В 1957 году были открыты белки противовирусной защиты – интерфероны (IFN). IFN I типа (IFNα / β) стимулируют экспрессию ISG (стимулированных интерфероном генов). Белковые продукты ISG борются с вирусами в инфицированных и соседних клетках. Для борьбы с вирусом у интерферонов два способа. Они могут воздействовать на жизненный цикл вируса, а могут нарушать метаболизм клетки и подавлять механизм трансляции.

Патогены или генетические свойства хозяина могут вызвать чрезмерную продукцию IFN. Это может спровоцировать тяжелые заболевания. Так происходит с гриппом, туберкулезом, волчанкой, ВИЧ и синдромом Айкарди-Гутьереса.

Из-за чрезмерной передачи сигналов IFNα / β могут возникнуть повреждения тканей и иммунный паралич — состояние, при котором иммунный ответ полностью отсутствует. Чтобы этого избежать, организм умеет регулировать уровень сигналов IFNα / β.

Организм регулирует уровень сигналов интерферона

Убиквитин — белок, который синтезируется во всех клетках, содержащих ядро (эукариотических). Убиквитин регулирует процессы деградации других белков внутри клетки. Также он регулирует активность сигнальных путей и влияет на передачу сигналов в ядро клетки. Присоединение убиквитина к белку-мишени называется убиквитинированием.

Каждый тип IFN взаимодействует со своим родственным рецептором. Рецептор клеточной поверхности IFN I типа — IFNAR. Он состоит из двух цепей: IFNAR1 и IFNAR2.

После передачи сигнала интерферона происходит убиквитинирование IFNAR1. Это приводит к временному подавлению рецепторов интерферона, что ограничивает дальнейшие ответы IFN. Описанный механизм защищает организм от воспалительных процессов.

Исследование: как временное подавление IFNAR1 влияет на избыточный сигнал IFN

Прайминг — подготовка клеток к последующему ответу на стимулирование.

Наивная клетка – зрелая клетка, способная выполнять весь спектр своих функций, но еще не стимулированная для ответа на определенный антиген.

Кишечная микробиота — сообщество комменсальных, симбиотических и патогенных микроорганизмов, обитающих в кишечнике. Микробиота имеет решающее значение для иммунологического, гормонального и метаболического гомеостаза хозяина.

Тонические сигналы – сигналы, вызванные постоянно присутствующими триггерами.

Чтобы понять, как временное подавление IFNAR1 влияет на избыточный сигнал IFNα / β, было проведено исследование на мышах, не способных убиквитинировать IFNAR1 после передачи сигнала интерферона (мыши Ifnar1SA). У таких мышей не происходит подавления рецептора интерферона, и сигнал IFN усиливается. У мышей Ifnar1SA повышен исходный уровень ISG.

Исследование показало, что:

  • Для точной настройки степени прайминга IFNα / β в наивных легочных клетках важна регуляция поверхностных уровней IFNAR1.
  • Из-за повышенного исходного уровня ISG мыши Ifnar1SA более устойчивы к заражению гриппом.
  • И у мышей Ifnar1SA, и у мышей дикого типа (WT) микробиота усиливает управляемую интерфероном экспрессию ISG. В большей степени это происходит в эпителиальных клетках.

Тонические сигналы IFN определяют силу индуцированных инфекцией сигналов IFNα / β и формируют устойчивость эпителиальных клеток к вирусной инфекции.

IFNAR1-зависимые сигналы управляют сигнатурой ISG в легочных стромальных и кроветворных клетках

Сигнатура — это единая или комбинированная группа генов в клетке с уникальным характерным паттерном экспрессии.

CD45 — маркер кроветворных клеток.

Было выдвинуто предположение, что у неинфицированных животных тонические сигналы IFNβ приводят к исходной активации пути IFN.

Чтобы выяснить, работает ли это как для кроветворных, так и для или стромальных клеток, измерили уровни ISG в CD45-позитивных и CD45-негативных клетках легких. В исследовании использовали мышей C57BL/6наиболее популярный вид лабораторных мышей. В ходе исследования вводили две дозы антитела aIFNAR1 (MAR1) с интервалом в 48 ч. Через два дня после второй инъекции обе группы клеток продемонстрировали, что после обработки происходит подавление стимулированных интерфероном генов Rsad2 и Oasl2.  Этот результат показывает, что тонические сигналы IFN управляют исходным уровнем ISG как в кроветворных, так и в стромальных клетках.

У мышей с дефицитом IFNAR1 (Ifnar1– / –) были более низкие уровни экспрессии ISG в обеих группах клеток. У этих мышей отсутствует передача сигналов IFNα / β. Этот результат означает, что и в кроветворных, и в стромальных клетках IFNAR1-зависимые сигналы управляют установившимися уровнями ISG.

Уровни IFNAR1 управляют базовой экспрессией ISG и иммунными реакциями, вызванными интерфероном

IFNAR1-зависимые сигналы поддерживают базовую сигнатуру ISG легких. Настройка уровней IFNAR1 — способ управления величиной сигнала IFN.

Для подтверждения этого были использованы мыши Ifnar1SA, не способные отключить сигнал IFN. Чтобы подтвердить, что у мышей Ifnar1SA не происходит подавления IFNAR1, полученные из костного мозга макрофаги (BMDM) обработали IFNα4. У клеток BMDM мышей Ifnar1+ / + C57BL/6  поверхностная экспрессия IFNAR1 снижалась в зависимости от дозы. У BMDM мышей Ifnar1SA экспрессия IFNAR1 поддерживалась на постоянном уровне для более низких концентраций IFNα4 .

По результатам флюоресцентно-активированного анализа сортировки клеток (FACS) в клетках наивных легких Ifnar1SA были повышенные исходные уровни экспрессии IFNAR1 и у иммунных клеток CD45+, и у эпителиальных и эндотелиальных клеток CD45-. Это означает, что постоянное подавление IFNAR1 ведет к установлению физиологического поверхностного уровня IFNAR1.

В легких мышей Ifnar1SA установившаяся экспрессия ISG была повышена. Это демонстрирует, что поверхностные уровни IFNAR1 управляют сигнатурой ISG. Блокада IFNAR1 снизила уровень ISG. Это показывает, что сигнатура ISG находится в динамическом равновесии, для поддержания которого нужны постоянные сигналы IFN.

Уровень ISG был повышен и в стромальных, и в кроветворных клетках. У иммунных клеток легких Ifnar1SA поверхностная экспрессия интерферон-индуцибельных белков Sca-1 и PDCA1 была повышена, в отличие от клеток C57BL/6.

Вместе эти результаты показывают, что поверхностные уровни IFNAR1 управляют физиологическими уровнями экспрессии ISG и в стромальных, и в кроветворных клетках. Так как естественная активация пути IFN I типа – механизм поддержания иммунного равновесия в слизистых оболочках неинфицированных мышей, этот факт играет важную роль для легочного иммунитета.

Изменения исходной экспрессии ISG в иммунных клетках отличались от изменений в составе иммунных клеток легких мышей Ifnar1SA. Этот факт согласуется с тем, что состав иммунных клеток в легких мышей Ifnar1– / – является неизменным. Значит, тонический сигнал IFN I типа поддерживает сигнатуру IFN в иммунных клетках, но не влияет на выживание и пополнение иммунных клеток.

Иначе ведут себя плазмоцитоидные дендритные клетки (pDC). Если сигнал IFN отсутствует, их число уменьшается. pDC поддерживаются интерфероном I типа и являются его источником.

В предыдущих опытах у мышей WT и Ifnar1SA наблюдалась экспрессия ISG. Чтобы узнать, вызвана ли она интерфероном, происходящим из pDC, были использованы истощающие антитела против маркера плазмоцитоидных дендритных клеток PDCA1. Истощение pDC не изменяло экспрессию ISG в легких. Значит, за установление исходной экспрессии ISG у мышей WT и Ifnar1SA отвечают другие клетки.

Мыши Ifnar1SA более устойчивы к заражению вирусом гриппа

MxA – фактор рестрикции вируса гриппа.

Мыши Ifnar1SA  MxAtg / tg — мыши с трансгеном, кодирующим человеческий MxA.

Как влияет на организм пониженная регуляция IFNAR1 во время заражения вирусом гриппа: усиливает ли она иммунопатологию или способствует противовирусной защите?

В ходе исследования было обнаружено, что мыши Ifnar1SA менее подвержены заражению вирусом гриппа, чем мыши WT. У мышей Ifnar1SA  экспрессия вирусных генов значительно снижалась через 8 ч., а репликация вируса — через 2 дня после заражения.

Высоковирулентным вирусом гриппа PR8 заразили мышей WT и Ifnar1SA  MxAtg / tg. У мышей Ifnar1SA  MxAtg / tg потеря веса была меньше, чем у контрольной группы WT. Это подтверждает описанный выше результат.

Что обеспечивает противовирусную защиту у мышей Ifnar1SA: исходные уровни ISG или повышенная чувствительность?

Через 16 ч. после заражения вирусная нагрузка снижалась в стромальных клетках легких Ifnar1SA. Это соответствовало более высоким уровням ISG в клетках Ifnar1SA по сравнению с клетками мышей WT. Позже 16 ч. после заражения дальнейшее повышение уровней ISG, опосредованное инфекцией, не обнаруживалось ни у мышей WT, ни у Ifnar1SA. На этой ранней стадии инфекции ни стромальные, ни иммунные клетки не демонстрировали индукцию мРНК интерферона. Через 8 ч. после заражения у мышей Ifnar1SA снижалась вирусная нагрузка. Повышение уровней ISG в строме или иммунных клетках в этот период не обнаруживалось. Эти результаты означают, что раннее снижение репликации вируса зависит от исходного антивирусного состояния, а не быстрой активации ISG.

Через 48 ч. после заражения у мышей Ifnar1SA снижался, а не повышался уровень белка IFN. Набор иммунных клеток в легкие не отличался у мышей WT и Ifnar1SA. Через 5 дней после заражения у мышей Ifnar1SA  MxAtg / tg снижались провоспалительные цитокины. Эти результаты показывают, что стабильная сигнатура ISG в строме легкого, регулируемая интерфероном, является определяющей для раннего контроля над вирусом гриппа. Вирусная нагрузка снижается, и иммунные реакции уменьшаются.

Также сниженный иммунный ответ объясняется тем, что мыши Ifnar1SA изначально менее реактивны. In vitro эпителиальные клетки дыхательных путей Ifnar1SA проявили большую реактивность к IFNα, чем контрольные клетки WT. In vivo у мышей Ifnar1SA  привлечение иммунных клеток в легкие, обработанные полиинозиновой кислотой (используется для имитации вирусных инфекций), было сильнее, чем у контрольной группы WT. Этот результат показывает, что у инфицированных вирусом гриппа мышей Ifnar1SA снижение иммунного ответа обусловлено уменьшением вирусной нагрузки через 8 ч. после заражения.

Микробиота управляет уровнем ISG в эпителии. Поэтому вирус гриппа притупляется на ранних этапах заражения. В течение первых восьми часов после заражения транскрипты вируса снижаются, а вирусные титры уменьшаются в первые два дня более чем в пять раз. Вирусная нагрузка снижалась рано, поэтому уменьшались и противовоспалительные иммунные реакции. Это поясняет тот факт, что у мышей Ifnar1SA, у которых повышены ответ на интерферон и иммунный ответ на раздражители, проявляют более слабый ответ IFN на вирус, чем контрольная группа мышей WT.

Повышенная экспрессия ISG в клетках CD45 является определяющей для ранней защиты от гриппа

Как влияют клетки CD45+ и CD45 на устойчивость мышей Ifnar1SA к вирусу гриппа

В исследовании использовались химеры костного мозга (BM) мышей C57BL/6 и Ifnar1SA . Через 6–8 недель после восстановления BM химер заразили гриппом. Потеря веса у химер Ifnar1SA была значительно ниже, чем у мышей C57BL/6. У мышей C57BL/6, которые получили костный мозг Ifnar1SA, потеря веса была значительно больше, чем у Ifnar1SA. В первые дни вирусной инфекции у мышей C57BL/6, которые получили костный мозг Ifnar1SA, признаки заболевания были более серьезными. Это показывает, что клетки CD45 являются определяющими для раннего подавления вируса.

На поздних стадиях заражения потеря веса у мышей Ifnar1SA, которые получали WT BM, была больше, чем у мышей контрольной группы, которые получали Ifnar1SA BM.

На разных стадиях инфекции за противовирусную защиту отвечают различные клеточные компартменты. Дисперсионный анализ для значений относительной массы тела на 3 и 9 день после заражения показал, что за изменение массы тела на 3 день отвечает генотип стромы, а на 9 день — взаимодействие между генотипами стромы и BM. Это значит, что для обеспечения ранней противовирусной защиты необходимы управляемые IFNAR1 сигналы в CD45 клетках. А для обеспечения поздней защиты нужны управляемые IFNAR1 сигналы в кроветворных клетках.

Микробиота управляет устойчивой сигнатурой ISG в строме легких, но не влияет на сигнатуру ISG в иммунных клетках

В чем причина повышенного уровня ISG у мышей Ifnar1SA

Чтобы проверить гипотезу о том, что причина – в уникальной микрофлоре в колонии мышей Ifnar1SA, мышей WT в течение месяца содержали вместе с мышами Ifnar1SA. Ни у мышей WT, ни у мышей Ifnar1SA экспрессия ISG в клетках легких не изменилась. У мышей Ifnar1SA сохранялись повышенные уровни ISG. Значит, уровень ISG повышен не из-за уникальной микрофлоры.

Мыши, которые получали пероральный антибиотик, более восприимчивы к вирусам. Чтобы проверить гипотезу о том, что на экспрессию ISG в легких влияет микробиота, в течение 4 недель мышам WT и Ifnar1SA давали антибиотик в питьевой воде. Антибиотик вызывал снижение экспрессии ISG в стромальном компартменте, но не влиял на клетки кроветворного происхождения.

Микробиота защищает строму легких от гриппа

Приводит ли повышенная экспрессия ISG к устойчивости к вирусам

Чтобы проверить, снимает ли блок репликации вируса снижение ISG антибиотиками у мышей Ifnar1SA, мышам WT и Ifnar1SA давали антибиотик в течение 4 недель. Контрольная группа антибиотик не получала. После 4 недель мышей инфицировали вирусом гриппа. Мыши Ifnar1SA, не получавшие антибиотик, были более устойчивыми к вирусу, чем мыши C57BL/6. Мыши Ifnar1SA, получавшие антибиотик, были так же восприимчивы, как и контрольная группа WT. Это значит, что за фенотип противовирусной устойчивости у мышей Ifnar1SA отвечают управляемые микробиотой сигналы. Антибиотики не изменили противовирусную устойчивость мышей WT. Возможная причина — в отсутствии фактора рестрикции гриппа MX1 у мышей C57BL/6.

Эксперимент повторили на мышах, у которых есть функциональный ген Mx ( MxA). Эта модель более похожа на человеческую. На ранних стадиях инфекции антибиотики увеличивали экспрессию вирусных генов и репликацию вируса у мышей Mx1+ / +. Это значит, что если есть фактор рестрикции гриппа, то микробиота влияет на ранний вирусный контроль.

Антибиотики увеличивали потерю веса и смертность и у мышей Mx1+ / +  Ifnar1wt, и у мышей Mx1+ / + Ifnar1SA. Мыши Mx1+ / +, экспрессирующие IFNAR1SA , были лучше защищены, чем WT.

Через 16 ч. после заражения вирусная нагрузка у мышей, которые получали антибиотик, увеличивалась. Антибиотики снижают противовирусное состояние в стромальных клетках легких. Микробиота вызывает праймирование стромальных клеток легких интерфероном и устанавливает противовирусное состояние, ведущее к подавлению гриппа на ранних стадиях.

Эти факты подчеркивают, что лечение антибиотиками нужно проводить с осторожностью. Если пероральные антибиотики применяются некорректно, они снижают противовирусную устойчивость эпителия, из-за чего форма гриппа может быть более тяжелой.

Кишечная микробиота отвечает за изменения исходной экспрессии ISG. Чтобы это подтвердить, мышам, принимавшим антибиотик, провели фекальную трансплантацию (FT) материалом  контрольной группы. Антибиотики снижали уровень ISG в стромальных клетках легких, а FT вернуло его к физиологическим значениям. FT давала одинаковый лечебный эффект как у мышей Ifnar1wt, так и у мышей Ifnar1SA.

Анализ GSEA базы данных MsigDB показал, что у мышей, принимавших антибиотик, подавлен сигнальный путь IFNα / β в строме легких. Также среди десяти наиболее значимых сигнальных путей было обнаружено несколько, связанных с иммунной системой и интерфероном. Все эти пути были усилены лечением фекальной трансплантацией. Лечение FT устранило вызванную антибиотиком чувствительность к гриппу.

Все эти результаты показывают, что микробиота усиливает управляемое интерфероном противовирусное состояние в стромальных клетках легких и увеличивает устойчивость к вирусу гриппа.

Тонкая настройка уровней IFNAR1 для баланса противовирусных и провоспалительных свойств IFN

Если повышенная поверхностная экспрессия IFNAR1 усиливает противовирусную защиту, то почему система IFN изначально не настроена на более высокие уровни?

Интерфероны I типа защищают хозяина от вирусов. Они взаимодействуют с рецептором интерферона (IFNAR1 / IFNAR2) и индуцируют передачу сигналов и экспрессию генов.

Воспалительные стимулы могут запускать убиквитинирование и подавление IFNAR1, тем самым ослабляя эффекты IFN in vitro.

Исследования на мышах Ifnar1SA показали, что у этих мышей усиливаются воспалительные состояния.

Мыши Ifnar1SA не способны убиквитинировать IFNAR1 после стимуляции рецепторного комплекса. Последующего подавления IFNAR1 не происходит, и сигнал IFN усиливается.

Это делает мышей Ifnar1SA очень восприимчивыми к многочисленным воспалительным синдромам, включая острый и хронический панкреатит, а также аутоиммунный и токсический гепатит.

Небольшое повышение поверхностной экспрессии IFNAR1 в клетках Ifnar1SA приводит к увеличению экспрессии интерферон-стимулированных генов (ISG) в иммунных клетках и стромальном компартменте.

Клетки пациентов с синдромом Дауна несут дополнительную копию генов Ifnar1 / 2 на хромосоме 21. Клетки этих людей экспрессируют повышенные поверхностные уровни IFNAR1 и производят повышенное количество провоспалительных цитокинов в ответ на вирус. В крови пациентов с синдромом Дауна повышена сигнатура ISG. Изменения состава белков крови у людей с синдромом Дауна похожи на изменения при интерферонопатиях I типа и прочих аутовоспалительных заболеваниях.

Эти факты и исследования на мышах Ifnar1SA показывают, насколько важна тонкая настройка поверхностных уровней IFNAR1 для баланса противовирусных и провоспалительных свойств системы интерферонов.

Источник