Один из вариантов лечения тяжелых больных с коронавирусной болезнью COVID-19 – введение плазмы выздоравливающих. При поиске потенциальных доноров плазмы с подтвержденной ПЦР инфекцией SARS-CoV-2 немецкие ученые обнаружили, что у 17% добровольцев – пограничные или отрицательные результаты анализа на антитела IgG к SARS-CoV-2 (соотношение антител <1,1). Ученые решили понаблюдать за этими добровольцами, повторив тесты на антитела и оценив Т-клеточный иммунитет с помощью анализа ELISpot на интерферон гамма. Иммуноферментный анализ ELISpot поможет понять, сколько людей все еще могут заразиться коронавирусом SARS-CoV-2. ELISpot выявляет пациентов с адаптивным Т-клеточным иммунитетом, который, как и антитела IgG, может защищать от заражения коронавирусом. ELISpot измеряет клеточный иммунитет в течение 1 дня на уровне отдельных клеток, определяет функциональные клетки. Результаты исследования на добровольцах с подтвержденной инфекцией SARS-CoV-2 позволяют предположить, что большинство людей с неопределяемым системным уровнем IgG могут быть защищены специфическим Т-клеточным иммунитетом.

Суть анализа IFN-γ ELISpot

T-лимфоциты – клетки, отвечающие за иммунный ответ на вторжение патогена. Они распознают и уничтожают зараженные клетки и стимулируют выработку антител. При стимуляции антигеном T-лимфоциты продуцируют интерферон гамма (IFN-γ). Иммуноферментный анализ ELISpot определяет наличие в сыворотке крови интерферона-γ.

Для стимуляции T-лимфоцитов использовались антигены – белки коронавируса SARS-CoV-2: S1 / S2 и мембранный белок M. С помощью белка-шипа S коронавирус проникает в клетку. Белок S – главная мишень нейтрализующих антител. Фрагмент S1 белка S отвечает за связывание вируса с клеткой, а фрагмент S2 – за слияние вирусной мембраны с клеточной мембраной. S1 – наиболее специфичный антиген для диагностики COVID-19. Фрагмент S2 может перекрестно реагировать с белком S коронавирусов SARS-CoV-1 и MERS-CoV. Однако уровень инфицирования SARS-CoV-1 и MERS-CoV у европейцев низок. Второй стимул T-лимфоцитов – мембранный белок М. Он играет центральную роль в сборке вирусных частиц и, скорее всего, является мишенью для перекрестно-реактивных Т-клеток.

Ответы антител и Т-лимфоцитов в группе выздоравливающих от COVID-19

С помощью ELISpot, специфичного для SARS-CoV-2, ученые проанализировали ответы Т-лимфоцитов в группе 78 потенциальных доноров плазмы с подтвержденной ПЦР инфекцией SARS-CoV-2. Отрицательный контроль – 22 человека без симптомов, связанных с COVID-19, и без бытовых контактов с инфицированными пациентами.

Средний интервал между появлением симптомов и первым забором крови у 78 доноров составлял 60 дней (диапазон 22–112 дней). 28 доноров позже были протестированы снова, в среднем через 75 дней (24–154 дня) после появления симптомов. Средний интервал между двумя заборами крови составлял 25 дней (диапазон 10–61 день). Соотношение антител >1,1 считалось положительным, от ≥0,8 до <1,1 – пограничным, <0,8 - отрицательным. Результаты анализа на антитела:

  • 13 из 78 (17%) доноров имели пограничные или отрицательные результаты (соотношение <1,1) анализа на антитела IgG к SARS-CoV-2.
  • Повторное тестирование у 10 участников с соотношением <1,1 показало, что большинство результатов по антителам (9/10) остались схожими.
  • У доноров с более высоким соотношением антител значения также остались на прежнем уровне.
  • У 1 добровольца с пограничным отношением значение со временем увеличилось и стало положительным.
  • У всех участников с соотношением антител <0,8 нейтрализующие антитела обнаружены не были.

Клеточный иммунитет определяли с 24 по 154 день после появления симптомов COVID-19 параллельно с тестированием на антитела. Ответ T-лимфоцитов определяли с помощью анализа IFN-γ ELISpot отдельно для каждого из различных стимулов: пептидных пулов белка S1 / S2, мембранного белка M и белкового антигена S1. Результаты анализа T-клеточного иммунитета:

  • Ни один из ответов ELISpot существенно не отличался между 9 участниками с неопределяемыми ответами антител (соотношение <1,1) и 15 участниками с высокими ответами антител (соотношение >3).
  • Ответы ELISpot на все стимулы у доноров были значительно выше, чем в группе отрицательного контроля.
  • Сила ответов на белок S1 была выше в группе с соотношением антител >3, чем в группе с соотношением <1,1.
  • Сила ответов на пептиды S1 / S2 была незначительно выше в группе с соотношением антител >3, чем в группе с соотношением <1,1, на пептид M - аналогично.
  • Сила ответов на пептиды S1 / S2 в целом была выше, чем на белок S1 отдельно.
  • Сила ответов T-клеток на стимулы в порядке возрастания: S1, S1 / S2, M. Такие ответы наблюдались как в группе с соотношением антител >3, так и в группе с соотношением <1,1.
  • Доноры, у которых соотношение антител было <1,1, показали устойчивые ответы, направленные на белок M, тогда как пациенты с соотношением антител>3 имели устойчивые ответы на белки S1 / S2, S1 и M.

Выводы

У потенциальных доноров плазмы с неопределяемыми антителами против белка S1 SARS-CoV-2 ответ Т-клеток на мембранный белок M был сильнее, чем на белок S1. Возможно, Т-клетки этих доноров предпочтительно нацеливаются на пептиды, участвующие в сборке вирусных частиц, а не в связывании вируса с клеткой. Однако эта гипотеза нуждается в подтверждении.

Ответы на пептиды S1 / S2 были сильнее, чем на белок S1, возможно, потому, что фрагменты макромолекулы антигена S2 вызывали более сильный иммунный ответ.

Интересно, что различия между участниками с соотношением антител <1,1 и >3, по-видимому, более выражены после стимуляции белком S1, чем пептидами S1 / S2. Таким образом, помимо белка М, белок S2 может быть дополнительной мишенью для Т-клеточных ответов, особенно у участников с неопределяемыми Т- и В-клеточными ответами против белка S1.

Обнаружение того, что ответ Т-клеток на белок S1, который является наиболее специфичным для SARS-CoV-2, был относительно низким, поднимает вопрос о потенциальной перекрестной реактивности после стимуляции пептидами S1 / S2 или М.

Перекрестная реактивность ранее наблюдалась для антител к SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2. Точно так же могут возникать перекрестно-реактивные к SARS-CoV-2 Т-клетки из-за контакта с распространенными коронавирусами. Это может повлиять на специфичность тестов ELISpot. Тем не менее, недавняя подтвержденная ПЦР инфекция SARS-CoV-2 могла привести к тому, что частота реактивных к SARS-CoV-2 Т-клеток была выше у потенциальных доноров плазмы, чем у тех, кто перенес другие распространенные коронавирусы. Кроме того, перекрестно-реактивные Т-клетки могут защищать от инфекции SARS-CoV-2, особенно детей и молодых людей с частыми социальными контактами. Исследование Braun et al. показало, что у 34% здоровых доноров плазмы есть ранее существовавшие SARS-CoV-2 S-перекрестно-реактивные CD4+ Т-клетки, а исследование Grifoni et al. обнаружило перекрестно-реактивные Т-клетки у 40% –60% лиц, не подвергавшихся воздействию коронавируса SARS-CoV-2. Однако из-за возможности того, что перекрестная реактивность мешает анализам ELISpot, ученые проверили Т-клеточные ответы в группе отрицательного контроля. Ответы были отрицательными.

Клеточный иммунитет к любому из антигенов SARS-CoV-2 был обнаружен у 7 из 9 (78%) участников, у которых соотношение антител было <1,1. Для сравнения, 12 из 15 (80%) участников с соотношением антител >3 имели определяемый клеточный иммунитет. Учитывая всех потенциальных доноров плазмы с подтвержденной ПЦР инфекцией SARS-CoV-2 (также с соотношением антител 1,1–3), 22 из 28 (79%) доноров имели T-клеточный иммунитет.

Таким образом, Т-клеточный иммунитет против SARS-CoV-2 наблюдался у большинства участников, положительных по ПЦР на SARS-CoV-2, с неопределяемыми антителами IgG к белку S1. В этой группе Т-клеточный иммунитет был сильнее направлен против белка М, чем против белка S1.

Защищает ли Т-клеточный иммунитет от повторного заражения коронавирусом

Отсутствие антител IgG к SARS-CoV-2 не означает, что человек не болел коронавирусом. Оценка клеточного иммунитета может дополнить данные о гуморальном ответе. Предыдущие исследования продемонстрировали, что величина ответа антител на SARS-CoV-2 зависит от продолжительности и силы воздействия вируса. Отсутствие устойчивых системных ответов IgG может указывать на легкую и временную инфекцию SARS-CoV-2, которая была эффективно устранена, например, врожденной иммунной системой. Однако необходимо выяснить, привел ли этот иммунный ответ к защитному иммунитету от коронавируса.

Chandrashekar et al. наблюдали почти полную защиту у 9 макак-резусов после инфекции SARS-CoV-2. После первоначального обезвреживания вируса при повторном заражении животные показали снижение средней вирусной нагрузки по сравнению с первичной инфекцией и устойчивый гуморальный и клеточный иммунный ответ. Deng et al. сообщили, что при повторном заражении SARS-CoV-2 у 4 макак-резусов наблюдалось временное повышение температуры тела, однако без вирусной нагрузки. Kirkcaldy et al. сообщили об ограниченных доказательствах повторного заражения среди перенесших COVID-19. Сингапурское исследование показало, что Т-клетки, специфичные для SARS-CoV-2, выявлялись у большинства выздоровевших пациентов. Данные о предыдущем коронавирусе SARS-CoV-1 показали, что клеточный иммунитет выявлялся в течение более 17 лет после заражения. Ученые Швеции и Франции наблюдали Т-клеточный ответ против SARS-CoV-2 у пациентов без антител к коронавирусу.

Данные IFN-γ ELISpot, полученные в среднем через 2 месяца после появления симптомов SARS-CoV-2, показывают, что 79% участников имели определяемый Т-клеточный иммунитет, что хорошо согласуется с предыдущими данными о структурно родственном коронавирусе SARS-CoV-1. Это означает, что у выздоравливающих пациентов с неопределяемым IgG к SARS-CoV-2 иммунитет могут обеспечивать Т-клетки.

Первоисточник

Cellular Immunity in COVID-19 Convalescents with PCR-Confirmed Infection but with Undetectable SARS-CoV-2–Specific IgG