Coronaviridae – это семейство одноцепочечных РНК-вирусов, которые могут инфицировать большинство видов домашних и диких животных, а также человека. Как правило, заражение человека коронавирусами приводит к легким симптомам со стороны дыхательных путей. Коронавирусы – одна из основных причин простуды. Однако за последние 18 лет мы стали свидетелями появления высокопатогенных коронавирусов человека, включая атипичную пневмонию SARS-CoV-1, ближневосточный респираторный синдром MERS-CoV и, в конце 2019 года, новый коронавирус SARS-CoV-2.

Хотя SARS-CoV-2 в основном нацелен на клетки эпителия легких и вызывает респираторную инфекцию, появляется все больше свидетельств того, что кишечный эпителий также может быть инфицирован. Многочисленные исследования сообщают о желудочно-кишечных симптомах, таких как диарея в начале заболевания, и выявляют длительное выделение большого количества геномов коронавируса в кале даже после того, как вирус не обнаруживается в ротоглоточных мазках. На сегодняшний день остается неизвестным, существует ли возможность фекальной передачи SARS-CoV-2, но учреждения здравоохранения во всем мире подчеркивают эту возможность.

Присутствие большого количества геномов коронавируса в кале вряд ли можно объяснить глотанием вируса, размножающегося в горле. Также маловероятно, что причина – в потере барьерной функции кишечного эпителия, которая позволит высвобождать геномы вируса внутри организма в просвет кишки. Скорее всего, большое количество геномов коронавируса в кале связано с активной репликацией в кишечном эпителии.

Многие коронавирусы животных хорошо известны как кишечные и передаются фекально-оральным путем. Ранее сообщалось о наличии SARS-CoV-1 и MERS-CoV в желудочно-кишечном тракте инфицированных.

Биопсия кишечника пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, показывает наличие реплицирующихся вирусов в эпителиальных клетках тонкой и толстой кишки. Инфекция SARS-CoV-2 желудочно-кишечного тракта подтверждается тем фактом, что рецептор вируса ACE2 экспрессируется в эпителиальных клетках кишечника, а анализ одноклеточного секвенирования показывает, что его экспрессия даже выше в клетках кишечника, чем в клетках легких.

Чтобы понять, как клетки эпителия кишечника (IECs) реагируют на вирус SARS-CoV-2, было проведено исследование.

Заражение эпителиальных клеток кишечника вирусом SARS-CoV-2

Сначала SARS-CoV-2 (штамм BavPat1) размножали в клеточной линии Vero зеленой обезьяны. Для выявления вирусной инфекции использовали антитело, направленное против области нуклеопротеина (N), которая консервативна между SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2. Кроме того, использовали антитело J2, которое обнаруживает двухцепочечную РНК (dsRNA). dsRNA является отличительной чертой репликации вируса РНК. Клетки, положительные на N, всегда были положительными на dsRNA. Супернатанты инфицированных клеток Vero собирали через 48 часов после заражения (hpi). Количество присутствующих частиц вируса (MOI, множественость инфекции – отношение количества вирусных частиц к количеству клеток-мишеней) измеряли с использованием подхода TCID50 для клеток Vero.

Затем клеточные линии T84 и Caco-2, полученные из рака толстой кишки, инфицировали SARS-CoV-2 при MOI 0,5 (как определено в клетках Vero). Эти клетки экспрессировали как ACE2, так и TMPRSS2. В разные периоды времени после заражения клетки T84 и Caco-2 фиксировали и окрашивали с помощью антител против N и против dsRNA.

Результаты показывают, что инфицированные SARS-CoV-2 клетки Caco-2 были обнаружены уже через 4 hpi, а через 24 hpi большинство клеток были инфицированы. Подобные результаты наблюдались в клетках T84, но обнаружение инфекции было немного задержано по сравнению с клетками Caco-2, и, хотя для заражения этих клеток было использовано такое же количество SARS-CoV-2, через 24 hpi были инфицированы только 20% клеток.

Эти наблюдения согласуются с увеличением числа копий вирусного генома с течением времени и выбросом частиц вируса в супернатант инфицированных клеток T84 и Caco-2.

Инфицирование человеческих эпителиальных клеток кишечника (hIECs) SARS-CoV-2 связано с генерацией IFN-опосредованного иммунного ответа. Одновременно с различиями между клетками T84 и Caco-2, наблюдаемыми в репликации и продукции вируса de novo, клетки T84 демонстрировали гораздо более сильный иммунный ответ, чем клетки Caco-2, хотя было инфицировано гораздо меньше клеток T84. Уровень белка, секретируемого IFN I типа, находился ниже предела обнаружения.

Эти результаты показывают, что IECs легко инфицируются SARS-CoV-2 и что инфицирование клеток Caco-2 приводит к более слабому внутреннему иммунному ответу, который связан с более высокой инфекционной продукцией вируса de novo по сравнению с клетками T84. Это наблюдение предполагает, что IFN-опосредованный иммунный ответ контролирует инфекцию SARS-CoV-2 в эпителиальных клетках кишечника.

IFN препятствует инфицированию эпителиальных клеток кишечника SARS-CoV-2

Чтобы определить функцию IFN в ограничении репликации SARS-CoV-2 и продукции вируса de novo в человеческих IEC, клетки T84 и Caco-2 подвергались фиктивной или предварительной обработке IFN I типа (IFN-β1) или IFN III типа (IFN-λ). Через 24 ч. после обработки клетки инфицировали SARS-CoV-2 при MOI 0,5 (как определено в клетках Vero) в присутствии или отсутствии IFN. Через 24 hpi клетки окрашивали с использованием антител как против N, так и против dsRNA.

Результаты показывают, что предварительная обработка клеток любым из IFN значительно влияла на инфицирование SARS-CoV-2 как клеток T84, так и Caco-2. Уменьшение числа инфицированных SARS-CoV-2 клеток, предварительно обработанных одним из IFN, было связано с ингибированием увеличения числа копий вирусного генома и значительным уменьшением высвобождения инфекционных частиц вируса de novo. Эти результаты показывают, что как IFN-β1, так и IFN-λ, могут эффективно предотвращать заражение эпителиальных клеток кишечника SARS-CoV-2. Это свидетельствует о том, что IFN-опосредованный иммунный ответ может контролировать инфекцию SARS-CoV-2 в человеческих IEC.

IFN-опосредованный иммунный ответ контролирует инфекцию SARS-CoV-2 в HIEC

Чтобы определить, контролируют ли эндогенные уровни IFN, генерируемые IEC, репликацию SARS-CoV-2 и производство вирусов de novo, использовали IEC, лишенные рецептора IFN I типа (IFNAR1; AR – / – ) или рецептора IFN III типа (IFNLR1; LR – / – ) или обедненные обоими рецепторами IFN (double knockout [dKO]). Чтобы контролировать, что клетки являлись нокаутными по рецептору IFN I типа (AR – / – ) и / или рецептору IFN III типа (LR – / – ), клетки T84 обрабатывали либо IFN, либо продукцией IFN-стимулированного гена (ISG) IFIT1. Нокаутные клетки рецептора IFN I типа (AR – / -) отвечали только на IFN-λ, тогда как клетки, нокаутные по рецептору IFN III типа (LR – / – ), отвечали только на IFN-β1. Клетки dKO рецептора IFN не реагировали ни на один из IFN.

Клетки T84 дикого типа (WT) и нокаутные по рецептору IFN клетки T84 инфицировали SARS-CoV-2 при MOI 0,1 (как определено в клетках T84). Через 24 hpi клетки иммуноокрашивали с использованием анти-N-антитела, а количество инфицированных клеток определяли с помощью флуоресцентной микроскопии.

Результаты показали, что истощение рецептора IFN I типа (AR – / – ) приводило к незначительному увеличению числа инфицированных клеток. А истощение рецептора IFN III типа (LR – / -) привело к увеличению числа инфицированных клеток в семь раз. Аналогичные результаты были получены, когда рецепторы IFN обоих типов (I и III) были истощены (dKO).

Увеличение числа инфицированных клеток при истощении рецептора IFN III типа (LR – / – ) было связано со значительным увеличением числа копий вирусного генома и с увеличением производства вирусов de novo на три порядка.

Вместе эти результаты позволяют предположить, что иммунный ответ, опосредованный IFN III типа, активно участвует в контроле инфекции SARS-CoV-2 в человеческих IECs.

Чтобы однозначно оценить важность IFN-опосредованного противовирусного ответа, использовали ингибитор pan-JAK (пиридон-6) для ингибирования активации фосфорилирования STAT1 и блокирования продукции ISG. Обработка клеток Т84 ингибитором pan-JAK полностью ингибирует передачу сигнала как рецепторов IFN I типа, так и рецепторов IFN III типа.

Клетки T84, обработанные имитацией и предварительно обработанные пиридоном-6, инфицировали SARS-CoV-2 в течение 24 часов и анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии после иммуноокрашивания с использованием антитела против N.

Результаты показывают как значительное увеличение числа инфицированных клеток, так и увеличение числа копий вирусного генома в клетках, обработанных ингибитором pan-JAK.

В соответствии с результатами, полученными в обедненных рецептором IFN III типа клетках, это увеличение числа инфицированных клеток также было связано с увеличением выработки инфекционных частиц вируса de novo. Эти результаты поддерживают модель, в которой IFN III-опосредованный иммунный ответ контролирует инфекцию SARS-CoV-2 в hIECs.

Первичные кишечные органоиды человека поддерживают инфицирование SARS-CoV-2, репликацию и образование вируса de novo

Чтобы выяснить, могут ли первичные hIEC инфицироваться SARS-CoV-2 и поддерживать производство вируса de novo, использовали органоиды, полученные из толстой кишки человека от двух разных доноров.

Интактная ультраструктурная организация и дифференцировка типов клеток (энтероциты, бокаловидные клетки, энтероэндокринные клетки, стволовые клетки) была подтверждена с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии и qRT-ПЦР против специфичных к клеточному типу транскриптов. Для дифференциации и инфицирования кишечных органоидов человека вирусами были использованы ранее установленные протоколы.

Недифференцированные органоиды высевали на камеры iBIDI, покрытые коллагеном человека. Через 24 ч. после посева дифференцировка была индуцирована удалением Wnt3a и уменьшением количества R-спондина и Ноггина в течение 4 дней. После полной дифференцировки органоиды были инфицированы SARS-CoV-2. Через 24 hpi инфекцию анализировали с помощью иммуноокрашивания с использованием анти-N и анти-dsRNA-антител и с помощью qRT-PCR.

Результаты показывают, что, независимо от донора, органоиды толстой кишки были инфицированы SARS-CoV-2. Это было отмечено присутствием клеток, положительных как для N, так и для dsRNA. Количественная оценка показала, что 8-13% клеток были инфицированы у каждого донора. Инфицирование было связано с увеличением количества копий вирусного генома.

Заражение органоидов не привело к выработке IFN I типа (IFN-β1), но привело к чрезвычайно сильной активации IFN III типа (IFN-λ).

Отсутствие выработки IFN I типа может быть связано с кинетической задержкой продукции IFN I типа по сравнению с IFN III типа, но это необходимо тщательно рассмотреть в дальнейших экспериментах. Другая возможность заключается в том, что SARS-CoV-2 кодирует специфический антагонист, который противодействует выработке только IFN I типа. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования, чтобы доказать эту концепцию.

Чтобы определить, могут ли экзогенно добавленные IFN предотвратить инфекцию SARS-CoV-2, органоиды толстой кишки подвергались фиктивной обработке или предварительной обработке IFN-β1 и IFN-λ, а затем инфицировались SARS-CoV-2 в течение 24 часов.

Результаты показывают, что предварительная обработка органоидов толстой кишки как IFN-β1, так и IFN-λ значительно ослабляет инфекцию. Такой эффект был связан с уменьшением количества копий генома SARS-CoV-2 и снижением производства инфекционных частиц вируса de novo.

В целом, эти результаты показывают, что органоиды толстой кишки человека могут поддерживать инфекцию SARS-CoV-2, репликацию и образование вирусов de novo, и что иммунный ответ, опосредованный IFN III типа, играет критическую роль в контроле репликации вируса.

Исследование поддержано исследовательским грантом Фонда Chica and Heinz Schaller и проектом Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Реакция эпителиальных клеток кишечника и легких на SARS-CoV -2

Хорошо известно, что клетки кишечного эпителия in vivo являются менее иммунореактивными из-за микроокружения кишечника (микробиоты и тканеспецифических иммунных клеток). Поэтому, скорее всего, IEC будут демонстрировать сильно ослабленный иммунный ответ, допускающий еще большую репликацию SARS-CoV-2.

Caco-2 являются отличными культуральными моделями, поддерживающими как SARS-CoV-2, так и SARS-CoV-1. Проведенное исследование подчеркивает потенциально решающую роль кишечных эпителиальных клеток в прогнозах пациентов с COVID-19.

Интересно, что инфицирование SARS-CoV-2 клеток эпителия легких человека Calu-3 также вызывает иммунный ответ, тогда как в клетках A549 (клетки аденокарциномы легкого), на моделях хорьков и в тканях легких человека инфекция SARS-CoV-2 приводит к ограниченному и приглушенному иммунному ответу, не индуцирующему IFN I и III типа.

Причина различий в количестве IFN при инфицировании легких и кишечных эпителиальных клеток в настоящее время неясна. Как и кишечные эпителиальные клетки, эпителиальные клетки легких обычно обладают высокой иммунной реакцией и вырабатывают интерфероны при вирусной инфекции. Отсутствие IFN в эпителиальных клетках легких после инфицирования SARS-CoV-2 может быть специфичным для этого вируса в этой ткани.

По сравнению с эпителием дыхательных путей, кишечный эпителий вызывает типичный противовирусный ответ. Это подчеркивает, что взаимодействие хозяина с патогеном следует рассматривать тканеспецифичным образом, поскольку могут быть установлены различные клеточные ответы и противовирусные меры для легких, кишечника и других органов.

Выводы

Характеристика кишечного жизненного цикла SARS-CoV-2 необходима для определения того, является ли вирусная инфекция, наблюдаемая в кишечнике, следствием фекальной / оральной передачи или проявлением распространения вируса из легкого в кишечник.

Результаты исследования позволяют предположить, что в начале инфицирования SARS-CoV-2 hIEC будет возникать противовирусный ответ через сигнальный путь IFN III типа. Поскольку иммунные клетки участвуют в формировании врожденного иммунного ответа, IFN I типа будет секретироваться из этих клеток и сможет воздействовать на эпителиальные клетки кишечника, дополнительно усиливая их антивирусное действие против SARS-CoV-2.

Что касается тяжелых легочных патологий, вызванных цитокиновым штормом, выводы о том, что эпителиальные клетки легких вызывают приглушенный иммунный ответ на инфекцию SARS-CoV-2, свидетельствуют о том, что цитокины происходят из альтернативного источника. Этот источник может быть из местных иммунных клеток или слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, учитывая сильный иммунный ответ, генерируемый первичными hIECs. Многие цитокины высвобождаются из эпителиальных клеток в направлении lamina propria и быстро попадают в кровообращение, чем потенциально способствуют воспалению и легочной патологии.

Чтобы эффективно бороться с пандемией, нужно полностью оценить сложность заболевания. Для этого необходимо, чтобы жизненный цикл вируса и его взаимодействие с хозяином были охарактеризованы для каждого места инфекции: как для легких, так и для кишечника.

hIECs являются продуктивным участком репликации SARS-CoV-2, и это может иметь решающее значение для изучения инфекции SARS-CoV-2 и патологий, наблюдаемых у пациентов с COVID-19. Результаты исследования подчеркивают решающую роль IFN III типа в ограничении SARS-CoV-2 в кишечном эпителии.

Источник:

https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(20)30844-5