Воспаление – естественная реакция иммунной системы на патогены. Эта реакция обеспечивается цитокинами для защиты организма. В некоторых случаях возникает гиперактивность иммунной системы – синдром высвобождения цитокинов.

Синдром высвобождения цитокинов (CRS) – опасное для жизни системное воспаление. Оно возникает как осложнение от лекарственной иммунотерапии рака и аутоиммунных заболеваний, а также как реакция иммунной системы на тяжелые вирусные заболевания. Среди симптомов CRS лихорадка, головная боль, боль в мышцах и суставах, утомляемость, сыпь, тошнота, гипотония. Симптомы CRS нарастают постепенно после иммунотерапии. Если симптомы усиливаются быстро, CRS называется цитокиновым штормом. CRS может привести к сердечно-сосудистому коллапсу, полиорганной недостаточности и смерти.

Возникновение CRS после иммунотерапии создает проблему в применении таких лекарственных препаратов, как онколитические вирусы и бактерии, рекомбинантные лимфокины, природные и биспецифические антитела, и Т-клетки, уничтожающие раковые клетки.

Лечение рака с помощью бактерий ANP- Clostridium novyi -NT

Растущей опухоли не хватает кровоснабжения, ее ткани испытывают гипоксию. Гипоксия подавляет противоопухолевый ответ иммунной системы. Из-за недостатка кислорода опухолевые клетки меняют свой метаболизм. Это делает их устойчивыми ко многим лекарственным препаратам.

Ученые исследовали лечение рака с помощью анаэробных спорообразующих бактерий Clostridium novyi -NT. Споры C. novyi -NT развиваются только в гипоксических тканях опухоли и могут их разрушить.

Но когда мышам в очень большие опухоли вводили большие дозы, происходил не только лизис опухоли, но и сепсис с сильным высвобождением цитокинов, вызванный бактериальной инфекцией. Сепсис невозможно было погасить антибиотиком метронидазолом, мыши умирали.

Даже когда мышей перед лечением обрабатывали противовоспалительными препаратами: дексаметазоном и антителами против TNF, рецептора IL-6 (IL-6R) и IL-3, улучшение давала только блокада IL-6R. Но на выживаемость это не повлияло.

Ученые изменили геном C. novyi -NT, добавив ему функцию высокой экспрессии предсердного натрийуретического пептида (ANP). ANP – пептидный гормон, который выделяют сердечные клетки, чтобы регулировать водно-электролитный гомеостаз. ANP снижает высвобождение цитокинов и обладает противовоспалительными свойствами, при этом не подавляет лизис опухоли. Новый геном был назван ANP- C. novyi -NT.

Введение ANP- C. novyi -NT в подкожно имплантированные опухоли CT26 привело к прорастанию и уменьшению опухоли. У мышей, которым вводили ANP- C. novyi -NT, уровни ANP и циклического GMP в плазме были в 2-4 раза выше, чем у мышей, которым вводили C. novyi -NT. Прорастание опухоли было одинаково эффективным у обоих штаммов. Но более 80% мышей, которым вводили ANP- C. novyi -NT, выжили, и у 84% опухоль полностью разрушилась. В случае введения C. novyi -NT не выжила ни одна мышь.

У мышей, которым вводили ANP- C. novyi -NT, воспаление и повреждения тканей были меньше, чем у мышей, которым вводили C. novyi -NT. В печени, селезенке и легких было меньше инфильтрирующих миелоидных клеток CD11b +. Уровни цитокинов миелоидного происхождения (IL-1β, IL-6, MIP-2), хемоаттрактантов (KC) и TNF и IFN-γ были значительно ниже. Также у мышей, которым вводили C. novyi -NT, была повышена легочная проницаемость и присутствовала миелоидная гиперплазия костного мозга.

Катехоламины – управляющие молекулы, среди них адреналин, норадреналин и дофамин.

У мышей, которых лечили ANP- C. novyi -NT, снижение воспаления сопровождалось заметно более низкими уровнями циркулирующих катехоламинов. Соотношение объема плазмы и объема красных кровяных клеток крови были одинаковыми у обеих групп мышей. Это показывает, что более низкие уровни циркулирующих катехоламинов не были связаны с изменениями объемного гомеостаза.

Чтобы подтвердить защитное действие ANP, перед лечением C. novyi -NT мышам подкожно имплантировали осмотические насосы ANP. 75% мышей выжило, у 77% опухоль полностью разрушилась. У 23% ответ на терапию был устойчивым, но не приводил к излечению. Вводимый системно ANP так же, как и ANP- C. novyi -NT, снижал уровень провоспалительных цитокинов, катехоламинов и повреждение тканей.

Какой катехоламин усиливает воспаление

Макрофаги – клетки иммунной системы, переваривающие чужеродные для организма частицы, бактерии, остатки мертвых клеток и раковые клетки. Макрофаги – основной источник воспалительных цитокинов. Макрофаги обнаруживают в организме чужеродные элементы и секретируют катехоламины. На катехоламины макрофаги реагируют увеличением продукции цитокинов.

У мышей после введения липополисахарида (LPS) наблюдалось высвобождение цитокинов. Мышам, получавшим LPS, подкожно имплантировали осмотические насосы, высвобождающие адреналин, норадреналин и дофамин. Обострение воспаления и высокий уровень смертности наблюдались только у получавших LPS мышей с адреналиновыми осмотическими насосами. У этих мышей уровни IL-6, TNF и KC были выше, чем у мышей, получавших только LPS или только адреналин, хотя у всех них повышались уровни цитокинов.

Как ANP влияет на синтез катехоламинов

Синтез катехоламинов под влиянием ANP исследовался на мышах в стимулированных перитонеальных макрофагах. Мышам вводили LPS. ANP снижал продукцию катехоламинов. Также снижались уровни IL-6, TNF, MIP-2 и KC. LPS в сочетании с адреналином усиливал воспаление. ANP снижал и этот усиленный воспалительный ответ.

Катехоламины синтезируются в следующем порядке: тирозин, L-ДОФА, дофамин, норадреналин, адреналин. Тирозингидроксилаза (ген TH) необходим для первого этапа синтеза катехоламинов.

α-метилтирозин (MTR) блокирует TH и превращение тирозина в L-ДОФА, чем подавляет синтез катехоламинов. MTR снижает уровни катехоламинов, которые продуцируют стимулированные макрофаги. Также под воздействием MTR снижаются уровни цитокинов, которые выделяют макрофаги. Результаты этих исследований на мышах подтвердились в исследованиях на человечески макрофагах.

Макрофагальные катехоламины вызывают воспалительную реакцию

Для исследования использовали мышей без гена TH в перитонеальных макрофагах. При стимуляции таких макрофагов LPS и адреналином продукция катехоламинов и цитокинов была снижена. Это подтверждает, что аутокринная продукция катехоламинов усиливает воспалительный ответ макрофагов. Интересно, что нарушение продукции катехоламинов снизило высвобождение цитокинов и смертность у мышей без гена TH в макрофагах.

MTR снижает уровни катехоламинов и цитокинов in vivo

Перед введением LPS мышам вводили MTR. 75% мышей выжили. В то время как в контрольной группе без MTR выжило только 10% мышей. MTR устойчиво снижал уровни катехоламинов и цитокинов и смертность. Влияние MTR было дозозависимым. Аналогичный результат у мышей, которым вводили LPS, наблюдался при блокаде α1-адренорецепторов. Эти рецепторы реагируют на норадреналин.

MTR и вызванный бактериальными инфекциями синдром высвобождения цитокинов

Лечение опухолей с помощью бактерий C. novyi -NT вызывает у мышей синдром высвобождения цитокинов и повышенную смертность. Перед введением C. novyi -NT мышам вводили MTR. MTR снижал уровни катехоламинов и цитокинов и значительно уменьшал смертность. Выжило 85% мышей по сравнению с 8% в контрольной группе.

  1. novyi-NT – грамположительные бактерии. В экспериментальных методах лечения рака используются также и грамотрицательные бактерии. Грамотрицательные бактерии также вызывают сепсис, но он отличается от сепсиса, вызываемого C. novyi-NT.

Ученые исследовали, как MTR влияет на смертность от сепсиса при лечении грамотрицательными бактериями. Исследование проводили на мышиной модели перевязки и пункции слепой кишки. MTR снижал уровни катехоламинов, цитокинов и смертность. 22% мышей пережили острую фазу. Все мыши в контрольной группе погибли. MTR в сочетании с β-лактамным антибиотиком имипенемом улучшал результат: выжило 67% мышей. В группе, получавшей только имипенем, выжило только 10%. Этот результат показывает, что на смертность влияют как бактериальные инфекции, так и реакция организма – синдром высвобождения цитокинов.

MTR и синдром высвобождения цитокинов, вызванный активаторами T-клеток

После лечения небактериальными препаратами, активирующими T-клетки, также происходит высвобождение цитокинов. Этот эффект важен для трансплантологии. Например, антитела против молекул T-клеток CD3 блокируют рецепторы T-клеток. Такое лечение ослабляет аутоиммунитет и снижает риск отторжения аллотрансплантанта, но вызывает активацию T-клеток и синдром высвобождения цитокинов.

Ученые исследовали, как влияет MTR на смертность после применения антител к CD3. Для исследования использовали иммунодефицитных мышей BALB / c в возрасте 5-6 месяцев. CD3 вызывал высвобождение цитокинов и повышение уровней катехоламинов. Предварительное введение MTR снижало уровни катехоламинов и цитокинов IL-6, TNF, MIP-2, KC. Уровни цитокинов IL-2 и IFN-γ не изменились. MTR снижал связанную с высвобождением цитокинов смертность. Аналогичные результаты наблюдались у мышей с отсутствием гена TH в макрофагах. У этих мышей не повышались уровни катехоламинов и цитокинов. Это подтверждает, что катехоламины миелоидных клеток играют важную роль в управлении CRS.

Синдром высвобождения цитокинов при лечении клетками CART

Для лечения рака также используются генетически сконструированные клетки T-клетки CARТ. На поверхности этих клеток сконструированы рецепторы, которые позволяют Т-клеткам распознавать и прикрепляться к определенному антигену на опухолевых клетках. Эти рецепторы названы рецепторами химерного антигена или CAR. Введенные пациенту клетки CART размножаются, распознают и убивают раковые клетки, которые несут антиген на своей поверхности.

Лечение клетками CART часто вызывает CRS. Для подавления CRS используется блокада IL-6R и IL-1R.

Ученые исследовали in vitro, экспрессируют ли CART повышенное количество катехоламинов, когда взаимодействуют с опухолевыми клетками. Для исследования использовали опухолевые клетки CD19+ Raji, полученные из лимфомы Беркитта человека. В качестве лечения использовали клетки hCART19 – клетки, направленные против CD19. Взаимодействие клеток Raji с клетками hCART19 вызывало высвобождение катехоламинов и цитокинов IL-2, TNF, IFN-γ, MIP-1α. И MTR, и ANP ослабляли этот эффект.

При добавлении адреналина к совместно культивированным клеткам Raji и hCART19 наблюдалось усиление экспрессии катехоламинов и цитокинов. Введение ингибитора синтеза белка циклогексимида (CHX) подавляло этот эффект. Этот результат показывает необходимость синтеза белка de novo.

Ученые исследовали, какую роль играют катехоламины в CRS in vivo при лечении CART19. Для исследования использовались взрослые трансгенные мыши NSGS, которые экспрессируют человеческие миелоидные цитокины IL-3, GM-CSF, SCF и моделируют человеческий CRS. Мышам вводили сублетальную дозу клеток Raji и клетки hCART19. Мышей разделили на две группы.

Первой группе hCART19 вводили в половину времени средней выживаемости нелеченных мышей. Это создавало высокий риск CRS из-за повышенной опухолевой нагрузки. Все мыши из первой группы умерли, потому что клетки hCART19 не могут спасти мышей с высокой опухолевой нагрузкой. На момент смерти у мышей из первой группы был избыточный уровень катехоламинов и цитокинов, происходящих из человеческих T-клеток (Hs IL-2, Hs IFN-γ и Hs TNF) и мышиных (Mm IL-6, Mm KC и Mm MIP-2). Предварительная обработка MTR значительно снизила уровни циркулирующих катехоламинов и человеческих, и мышиных цитокинов, но мыши все равно умерли от прогрессирующего заболевания.

Второй группе hCART19 вводили через треть времени средней выживаемости. В этом случае опухолевая нагрузка низкая, и есть возможность оценить противоопухолевый ответ. Клетки hCART19 уничтожали опухоль, в большей степени у мышей, предварительно обработанных MTR. MTR значительно снизил уровень катехоламинов и цитокинов Hs TNF, Mm IL-6 и Mm KC и в меньшей степени Hs IFN-γ и Hs IL-2. ANP дал аналогичные результаты. Ни MTR, ни ANP не мешали hCART19 размножаться и уничтожать опухоль. Они оба эффективно предотвращали CRS.

У мышей, которым вводили такое же количество нетрансдуцированных Т-клеток (UT-T), уровни катехоламинов, цитокинов и выживаемость не изменились.

Эффекты MTR и ANP проверили на сингенной модели мыши. Мышам вводили мышиные лейкозные клетки. Затем мышей лечили клетками mCART19 против мышиного CD19. Предварительная обработка MTR и ANP не снижала эффект mCART19, но снижала системный уровень катехоламинов и цитокинов. Этот результат подтверждает, что MTR и ANP могут предотвращать CRS при сохранении противоопухолевой эффективности.

Катехоламины усиливают воспалительное повреждение, вызванное бактериальными и небактериальными причинами. Это происходит по причине самоусиливающейся катехоламиновой петли прямой связи в миелоидных клетках. Возможно, в этом процессе также участвуют T-клетки и клетки надпочечников, которые тоже производят катехоламины. Для синтеза катехоламинов необходим ген TH. α1-адренорецепторы иммунных клеток реагируют на катехоламины. Чтобы разорвать эту цепь и снизить воспалительный ответ, могут применяться MTR и α1-адреноблокатор празозин. Оба препарата одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов для лечения гипертензии. Поэтому их применение возможно в клинических испытаниях лекарственных препаратов, использование которых ограничено риском CRS.

Источник