Для борьбы с инфекционными болезнями разработаны различные методы лечения, включая иммунотерапию и антибиотикотерапию. Однако из-за высокой скорости мутации вирусов и увеличения числа инфекционных заболеваний необходимы новые, более эффективные методы лечения. Одним из перспективных направлений стали интерфероны (ИФН) — белки, которые вырабатываются клетками в ответ на вирусные инфекции и другие стимулы и оказывают противовирусное, иммуномодулирующее и противовоспалительное действие. Интерфероны применяются при гепатите, COVID-19, раке и рассеянном склерозе.

Интерфероны подразделяются на три типа в зависимости от специфичности их рецепторов и генетической структуры:

• I типа: ИФН-α, ИФН-β, ИФН-ε, ИФН-κ и ИФН-ω — в основном вырабатываются плазмоцитоидными дендритными клетками и другими лейкоцитами;
• II типа: ИФН-γ — в основном вырабатывается Т-клетками и NK-клетками;
• III типа: ИФН-λ1, ИФН-λ2 и ИФН-λ3 — вырабатываются в основном эпителиальными клетками.

Непрерывно ведутся исследования по созданию масштабируемых систем получения ИФН с высоким выходом (измеряется в единицах интерферона на клетку — МЕ/клетку), чистотой и безопасностью при низкой стоимости. Индийские ученые опубликовали обзор, в котором собрали данные о вирусах, прокариотах (бактериях и археях) и эукариотах (дрожжах и животных клетках), которые могут использоваться для производства интерферонов.

Типы систем производства ИФН и методы, используемые для определения концентрации ИФН

Традиционно интерфероны получали с помощью бактериальной ферментации, но этот метод связан с такими проблемами, как загрязнение, временные затраты и трудоемкость. Культуры клеток животных дают больше ИФН и позволяют лучше контролировать качество, однако их использование дорого и вызывает этические вопросы. В качестве альтернативы рассматриваются растительные и дрожжевые клетки: растения обеспечивают устойчивое и дешевое производство, а дрожжи — быстрое и удобное для масштабирования. Синтетическая биология и метаболическая инженерия предлагают новые подходы для более эффективного получения ИФН.

Бактериальные системы популярны из-за низкой стоимости и простоты масштабирования, но у них есть недостатки:

• отсутствие посттрансляционных модификаций, которое может привести к снижению активности и нестабильности ИФН;
• возможные иммунные реакции;
• загрязнение эндотоксинами;
• формирование нерастворимых скоплений ИФН, снижающих выход активного ИФН.

Поэтому для таких систем разрабатываются способы улучшения качества и выхода ИФН.

Для измерения продукции ИФН применяются методы:

• внутриклеточное окрашивание и проточная цитометрия для оценки на клеточном уровне;
• иммуноферментный анализ (ИФА) для измерения концентрации в культуральной среде или крови с помощью специфических антител и ферментов;
• биологические тесты для определения активности интерферона и его способности защищать клетки от вирусных инфекций или активировать противовирусные гены.

Выбор метода зависит от необходимой точности и доступного оборудования.

Выработка интерферона в вирусных системах

Интерфероны — белки, которые синтезируются иммунными клетками для защиты организма, прежде всего от вирусов. В зависимости от вируса, триггером для выработки ИФН служит капсидный белок или нуклеиновая кислота. Цель собранных ниже данных — оценить, какие вирусы лучше всего стимулируют выработку ИФН.

Вирус болезни Ньюкасла

Вирус болезни Ньюкасла (NDV) показал, что некоторые его штаммы (Ulster, Queensland, NDV-I8, мезогенный штамм H) способны вызывать значительную выработку ИФН (20-320 МЕ/культуру) в клетках эмбрионов цыплят. Для макрофагов мышей продукция интерферона зависела от дозы вируса: более высокая концентрация NDV приводила к большему выходу ИФН. Например, макрофаги мышей C57BL/6 при высоких дозах NDV производили до 16 200 МЕ/культуру, тогда как макрофаги мышей BALB/c — значительно меньше.

Вирус Сендай

Вирус Сендай также сильно стимулировал выработку ИФН: среди всех лейкоцитов моноциты продуцировали самый высокий титр интерферона — 10 240 МЕ/мл. Среди клеток плаценты наибольшую продукцию интерферона показали плацентарные макрофаги — около 12 800 МЕ/10⁶ клеток, тогда как трофобласты и клетки линии хориокарциномы продуцировали меньшее количество ИФН.

Вирус гриппа

Вирус гриппа — один из основных возбудителей респираторных инфекций у человека. Из-за высокой изменчивости он вызывает пандемии каждые 10-50 лет, что делает практически невозможным создание вакцин. Альтернативой вакцинам может быть интерферон, который ограничивает размножение вирусов.

В исследованиях вирус гриппа A использовали для стимуляции продукции ИФН в иммунных клетках человека. Макрофаги, выделенные из венозной крови, продуцировали от 100 до 800 МЕ/мл ИФН (медиана — 200 МЕ/мл), тогда как лимфоциты и мононуклеарные лейкоциты не вырабатывали интерферон.

У 36 человек, вакцинированных против гриппа, исследовали продукцию ИФН в ответ на живой вирус через 7, 14 и 180 дней после прививки. Максимальная продукция наблюдалась на 7-й день (10 000 МЕ/мл), затем постепенно снижалась до 4000 МЕ/мл через полгода.

В другом исследовании мышам вводили термически убитые бактерии Lactobacillus plantarum, которые были инфицированы вирусом гриппа. Уровень ИФН-β в сыворотке крови у этих мышей был выше, чем у контрольной группы.

Вирус везикулярного стоматита (VSV)

Вирус везикулярного стоматита (VSV) привлекает внимание благодаря способности избирательно размножаться в опухолевых клетках и используется в онкотерапии и для лечения ВИЧ.

Исследования сравнивают способность стимулировать выработку интерферонов у штамма дикого типа (LiVSV) и мутантного варианта с пониженной способностью к распространению, формирующего мелкие бляшки (S2VSV). При культивировании в линии мышиных фибробластов (клетки L) S2VSV вызывал продукцию ИФН 1200 МЕ/3 мл при 0,1 MOI, тогда как LiVSV в этих клетках не вызывал выработки ИФН. В клетках куриного эмбриона (CE) LiVSV при 10 MOI стимулировал продукцию 100 МЕ/3 мл ИФН, что превышало значения, полученные для S2VSV в тех же условиях.

Эксперименты на мышах показали, что VSV дикого типа не вызывал продукцию интерферона I типа ни in vitro, ни в центральной нервной системе. В то же время мутантный VSV с изменением белка M (T1026R1) стимулировал продукцию ИФН-β как in vitro, так и в ЦНС.

Вирус простого герпеса

Вирус простого герпеса (HSV) поражает около трети населения США. У большинства он вызывает легкие кожно-слизистые инфекции, но у людей с ослабленным иммунитетом может приводить к тяжелым осложнениям. Интерфероны играют ключевую роль в защите таких пациентов.

Два штамма HSV-1 — F и McIntyre — использовали для заражения кератиноцитов, выделенных из кожи лица здоровых людей. Штамм F при MOI 1 стимулировал выработку 1222 МЕ/мл ИФН-β, тогда как McIntyre — только 136 МЕ/мл.

У мышей с герпетическим поражением роговицы внутривенное введение HSV-1, инактивированного ультрафиолетовым излучением, вызывало выработку ИФН (в среднем 122 МЕ/мл) через 24 ч после инъекции и снижало тяжесть заболевания. Это доказало, что не только живой, но и инактивированный ультрафиолетом вирус HSV-1 мощно стимулирует выработку ИФН.

В другом исследовании ученые проанализировали способность отдельных вирусных гликопротеинов HSV-1 вызывать продукцию ИФН-α. Среди всех гликопротеинов только клетки Sf9, экспрессирующие поверхностные гликопротеины вируса gD1 и gD2, стимулировали высокую продукцию ИФН-α — 1625 ± 934 и 1879 ± 1033 МЕ/мл соответственно.

Вирус гепатита

Вирус мышиного гепатита (MHV) вызывает у мышей различные заболевания, а чувствительность к нему зависит от активности макрофагов и выработки интерферонов. При внутривенном введении штамма MHV-D мышам C3H и C57BL выяснилось, что селезенка мышей C3H продуцировала до 54 000 МЕ интерферона за 12 часов, тогда как у мышей C57BL уровень ИФН был значительно ниже — не более 10 000 МЕ.

Для вируса гепатита А (HAV), вызывающего некроз печени, отмечается защитная роль интерферона-гамма. В исследовании лимфоцитов периферической крови у пациентов с острой HAV-инфекцией обнаружено повышенное содержание ИФН-γ — в среднем около 430 МЕ/мл, тогда как в контрольной группе оно не превышало 14 МЕ/мл. Ученые продемонстрировали, что ИФН-γ может ограничивать инфекцию HAV, оказывая прямое противовирусное действие. Более того, высвобождаемый ИФН может предотвращать распространение вируса на соседние клетки.

Производство интерферона с помощью вирусных векторов

Интерфероны применяются не только при вирусных инфекциях, но и в онкологии, что создает дополнительный спрос на их производство. Одним из эффективных подходов является использование вирусных векторов: они обеспечивают быстрый синтез интерферонов благодаря активным участкам ДНК и применимости в разных типах клеток. Однако в организме такие векторы могут быстро уничтожаться иммунной системой, что ограничивает их применение in vivo.

Рассматриваются различные вирусные платформы для экспрессии ИФН:

• Рекомбинантный вирус гепатита В утки (rDHBV), содержащий ген утиного ИФН-I, не только продуцировал ИФН-I, но и подавлял репликацию дикого вируса в клетках печени утки.
• Вектор на основе вируса везикулярного стоматита (VSV), содержащий гены ИФН-β человека и мыши, экспрессировал интерферон в линии почечных клеток хомяка BHK-21.
• Векторы на базе вируса иммунодефицита обезьян (SIV) с геном ИФН-γ показали разную эффективность в клетках человека и макак. Наилучшие результаты дал вектор SIV HyIFN.
• Растительный вирус желтой мозаики кабачков (ZYMV), содержащий ген ИФН-γ, экспрессировал интерферон — его присутствие в сырых экстрактах кабачка было подтверждено иммуноблоттингом и ИФА.
• Адено-ассоциированный вирус (AAV), несущий ген ИФН-β, вызывал гибель клеток глиомы in vitro. При введении в мозг мышей клеток глиомы человека, модифицированных этим вектором, наблюдалась выработка интерферона-β и белка теплового шока (HSP).
• Вектор на основе вируса Семлики Форест обеспечил продукцию мышиного ИФН-γ в клетках BHK-21 до 796 нг/мл.
• Бакуловирусный вектор на основе вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда (BmNPV) с геном ИФН-α использовали для заражения личинок шелкопряда и выработки ИФН-α в гемолимфе.

Производство рекомбинантного ИФН в прокариотических и дрожжевых системах

Интерфероны вырабатываются эукариотическими клетками в ответ на вирусную инфекцию и участвуют в активации клеток иммунной системы. Однако выработка ИФН в прокариотических организмах — бактериях и дрожжах — изучена меньше. Современные исследования сосредоточены на возможности синтетического производства различных типов интерферонов: α, β, λ и γ в этих системах.

В целом, дрожжевые системы показывают более высокую продуктивность по сравнению с бактериальными. Например, выход ИФН, продуцируемого бактериальной системой, варьируется от 2 до 100 мг/л, в то время как выход ИФН, продуцируемого дрожжевой системой, варьируется от 5 до 500 мг/л.

Среди бактериальных систем наиболее высокую продукцию ИФН-α2b обеспечивает E. coli BL21 (DE3) с вектором pET26b + IFN-α2b при использовании среды, в которой экспрессия ИФН запускалась при добавлении галактозы.

Бактериальные системы

Интерфероны α-2a и α-2b — рекомбинантные белки, полученные из модифицированных бактерий Escherichia coli, несущих гены человеческих интерферонов. Оба ИФН отличаются высокой чистотой и противовирусной активностью: около 2×10⁸ МЕ/мг для α-2a и 2,6×10⁸ МЕ/мг для α-2b. Интерфероны α-2a и α-2b применяются для лечения хронического гепатита С и миелоидного лейкоза.

Бактериальные системы различаются по выходу, активности, безопасности и стабильности ИФН. E. coli обеспечивают максимальный выход и активность, но требует тщательной очистки от эндотоксинов и включений. Bacillus subtilis имеют более низкий выход и активность ИФН, но более высокую безопасность из-за отсутствия эндотоксинов и секреции интерферона в культуральную среду. Lactococcus lactis имеют самый низкий выход и активность ИФН, но высокую безопасность из-за использования пищевых штаммов и возможности секреции интерферона прямо в молоко. Corynebacterium glutamicum обеспечивают умеренный выход и высокую стабильность ИФН благодаря дисульфидным связям и устойчивости к протеазам.

Выбор системы зависит от целей:

• E. coli подходит для промышленного производства и терапевтического использования, но требует многоступенчатой очистки для удаления эндотоксинов и нерастворимых включений и восстановления активной формы белка;
• B. subtilis — для лабораторных исследований и диагностических целей;
• L. lactis — для пероральной доставки интерферона для иммунитета слизистых оболочек;
• C. glutamicum — для длительного хранения и транспортировки ИФН.

Дрожжевые системы

Дрожжевые системы демонстрируют широкий диапазон продукции интерферонов: от 1 000 до 46 000 000 МЕ/мл. Наиболее высокую концентрацию — 2 700 000 МЕ/мл — удалось получить при использовании Pichia pastoris, а наименьшую — 1 000 МЕ/мл — при использовании Saccharomyces cerevisiae. Концентрация рекомбинантного интерферона зависит от штамма дрожжей, типа экспрессируемого интерферона, условий культивирования и метода очистки.

P. pastoris часто предпочитают для производства рекомбинантных белков, включая интерфероны, благодаря высокой способности секретировать белки, что повышает выход. Концентрация рекомбинантного интерферона, продуцируемого P. pastoris, может достигать 276 мг/мл и выше. У S. cerevisiae выход ниже — от 0,01 до 1 мг/мл, хотя S. cerevisiae также широко используется для производства рекомбинантных интерферонов.

Интерфероноподобные молекулы, которые вырабатываются прокариотами при заражении вирусами

Бактерии

Хотя бактерии не производят интерфероны из-за отсутствия соответствующих сигнальных путей и компонентов иммунной системы, они способны вырабатывать молекулы с интерфероноподобной активностью:

• Lactobacillus acidophilus вырабатывают белок IBP, способный связываться с рецепторами интерферонов α/β у млекопитающих. Продукция IBP составляет 30-50 нг/мл, что соответствует 0,03-0,05 МЕ/клетку.
• L. acidophilus вырабатывают белок LAP-A. Он схож по молекулярной массе с интерферонами I типа и способен вызывать противовирусный ответ в человеческих клетках. Его продукция составляет 0,1-1,0 мкг/мл, что эквивалентно 0,0001-0,001 МЕ/клетку.

Археи

Археи — прокариоты, обитающие в экстремальных условиях: горячих и глубоководных гидротермальных источниках. Как и бактерии, некоторые археи производят интерфероноподобные молекулы, которые могут активировать иммунные реакции:

• Methanocaldococcus jannaschii синтезируют белок MJ0044, вызывающий интерфероноподобные реакции в клетках млекопитающих.
• Sulfolobus solfataricus производят белок p43 в концентрации 10-20 мкг/мл, что эквивалентно 0,01-0,02 МЕ/клетку.
• Sulfolobus islandicus производят белок STIV-S1 в концентрации 10 мкг/мл, что соответствует 0,01 МЕ/клетку.

Цианобактерии

Цианобактерии производят множество молекул иммунной системы, включая похожие на интерфероны. Например, Synechocystis sp. производят белок SyIFN, который вызывает противовирусные реакции в клетках млекопитающих. Однако производство интерферонов у цианобактерий до сих пор не очень хорошо изучено.

Миксобактерии

Миксобактерии — это социальные бактерии, которые живут колониями и имеют сложные пути развития. Миксобактерии производят различные молекулы иммунной системы, включая похожие на интерфероны. Например, Myxococcus xanthus производят белок MxIFN, который вызывает противовирусные реакции в клетках млекопитающих. Для полного понимания механизмов выработки интерферона в этих организмах необходимы дополнительные исследования.

Полезная статья, нужная информация? Поделитесь ею!

Кому-то она тоже будет полезной и нужной:

Источник

Interferon production by Viral, Bacterial & Yeast system: A comparative overview in 2023

Наш канал в Telegram:

Статьи по схожим темам: