31 декабря 2019 года в Ухане, Китай, была зарегистрирована группа случаев пневмонии неизвестной этиологии. 10 января 2020 года в качестве возбудителя был идентифицирован новый коронавирус, названный SARS-CoV-2 и классифицированный в род Бетакоронавирусов. 20 апреля 2020 года, через 5 недель после того, как Всемирная организация здравоохранения объявила COVID-19 пандемией, новая коронавирусная болезнь COVID-19 вызвала более 166 000 смертей среди 2,5 миллионов подтвержденных случаев заболевания, зарегистрированных по меньшей мере в 185 странах или территориях по всему миру.

Новый коронавирус SARS-CoV-2 имеет идентичность геномных последовательностей с предыдущими коронавирусами SARS-CoV и MERS-CoV ≈79% и ≈50% соответственно. Все три вируса различаются с точки зрения эпидемиологии и физиопатологии.

Сейчас нет ни специфического противовирусного лечения, ни вакцины против любого из этих трех коронавирусов. Стандартное ведение пациентов основывается главным образом на лечении симптомов и респираторной поддержке, когда это необходимо.

Для изучения особенностей SARS-CoV-2 и индуцированного им COVID-19 необходимы биологически релевантные доклинические экспериментальные модели инфекции SARS-CoV-2 в качестве дополнения к клеточной линии африканской зеленой обезьяны Vero E6.

Ранее сообщалось о преимуществе использования восстановленного эпителия дыхательных путей человека (HAE) в качестве физиологически релевантной модели для выделения, культивирования и изучения широкого спектра респираторных вирусов. Разработанные на основе биопсий назальных или бронхиальных клеток, дифференцированных в воздушно-жидкостной интерфазе, эти модели с высокой точностью воспроизводят большинство основных структурных, функциональных и врожденных иммунных особенностей респираторного эпителия человека. Эти особенности играют центральную роль на ранних стадиях инфекции и являются надежными суррогатами для изучения механизмов заболеваний дыхательных путей и открытия лекарств.

Исследование кинетики SARS-CoV-2 и индуцированных им тканевого ремоделирования клеточной ультраструктуры и ранних транскрипционных иммунных сигнатур

В исследовании первоначально выделили вирус SARS-CoV-2 из мазка из носа одного из первых госпитализированных пациентов с подтвержденным COVID-19 во Франции. Число копий вирусной ДНК увеличили в клетках африканской зеленой обезьяны Vero E6. Затем использовали восстановленные эпителиальные модели дыхательных путей человека (HAE) назального и бронхиального происхождения, чтобы изучить кинетику SARS-CoV-2 и индуцированные им тканевое ремоделирование клеточной ультраструктуры и транскрипционные иммунные сигнатуры, и чтобы оценить терапевтический потенциал комбинированной терапии COVID-19.

Выделение и характеристика SARS-CoV-2 в клетках Vero E6 и HAE

Полная последовательность генома выделенного вируса SARS-CoV-2 депонирована в базе данных Gisaid EpiCoVTM по ссылке BetaCoV/France/IDF0571/2020 (идентификатор доступа EPI_ISL_411218). Филогенетический анализ подтвердил, что выделенный вирус является репрезентативным для циркулирующих в настоящее время штаммов.

Репликативная способность SARS-CoV-2 в клетках Vero E6 была изучена при различной множественности инфекции (MOI) (рис. 1А), используя как классическое определение инфекционного титра в клеточной культуре (TCID50), так и молекулярно-полуколичественные методы, основанные на специфических праймерах ORF1b-nsp14 и зондах, разработанных Школой общественного здравоохранения Гонконгского университета. Этот двусторонний подход показал четко наблюдаемый цитопатический эффект через 48 часов после заражения (hpi) (рис. 1B) и позволил проверить большой интервал (диапазон 1-8 log10 (TCID50)) с высокой корреляцией (R2 0,94) между молекулярными и инфекционными вирусными титрами (рис. 1C).

Рисунок 1. Характеристика инфекционной модели SARS-CoV-2 в клетках Vero E6, а также в восстановленном назальном и бронхиальном HAE

В ходе исследования носовую слизь, полученную из назального мазка (MucilAir HAE), инокулировали на апикальной поверхности HAE, что было подтверждено наблюдениями просвечивающей электронной микроскопии. Высокое накопление потомственных вирионов в бокаловидных клетках-продуцентах слизи было легко различимо как на апикальной, так и на базальной сторонах HAE через 48 hpi.

Затем для проведения экспериментального инфицирования SARS-CoV-2 использовали модель MucilAir HAE и протоколы, ранее оптимизированные для различных респираторных вирусов. Репликацию вируса контролировали путем повторного отбора проб и титрования TCID50 на апикальной поверхности HAE (рис. 1D). Трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER), которое считается суррогатом целостности эпителия, также измерялось во время течения инфекции (рис. 1Е). Параллельно проводилось сравнительное количественное определение молекулярного вирусного генома на трех уровнях воздушно-жидкостной интерфазы HAE: в апикальных смывах (рис. 1F, апикальный), общей клеточной РНК (рис. 1G, внутриклеточный) и базальной среде (рис. 1H, базальный).

Продукция вируса SARS-CoV-2 на апикальной поверхности эпителия резко увеличивалась через 48 hpi, причем самые высокие титры вируса (>7 log10 TCID50/мл) наблюдались через 72-96 hpi (рис. 1D и 1F). Резкое увеличение вирусной репликации коррелировало со снижением целостности эпителия через 48 hpi, что отражалось >2,8- и 4-кратным снижением значений TEER HAE бронхов и носа соответственно, с последующим частичным восстановлением в случае бронхиального HAE (рис. 1Е).

Кроме того, вирусная продукция на апикальном полюсе хорошо коррелировала с внутриклеточным обнаружением вирусного генома через 48 hpi, за исключением назального HAE. В назальном HAE наблюдалось сильное относительное увеличение РНК nsp14 (рис. 1F). Вирусный геном был обнаружен в базальной среде через 48 hpi и далее (рис. 1H), что косвенно подтверждает нарушение целостности эпителия, вызванное инфекцией через 48 hpi и ранее выявленное с помощью измерений TEER.

SARS-CoV-2 индуцирует ремоделирование клеточной ультраструктуры HAE

Чтобы дополнительно охарактеризовать биологию SARS-CoV-2, инокулировали как назальный (рис. 2А и 2Б), так и бронхиальный (рис. 2С и 2D) HAE и проанализировали индуцированное инфекцией ремоделирование клеточной ультраструктуры с помощью просвечивающей электронной микроскопии.

Через 48 hpi реснитчатые, бокаловидные и в меньшей степени базальные клетки обоих HAE демонстрировали активную продукцию вирусного потомства. Это наблюдение согласуется с результатами вирусной репликации, описанными на рис. 1, а также с недавним исследованием, в котором сообщалось о высоких уровнях экспрессии рецептора ангиотензин-превращающего фермента SARS-CoV-2 (ACE2) как в реснитчатых, так и в бокаловидных респираторных клетках.

Как ранее наблюдалось в структурных исследованиях других коронавирусов, в частности SARS-CoV и MERS-CoV, в ходе исследования были выделены характерные кластеры в перинуклеарной области инфицированных клеток HAE. Эти кластеры в основном состоят из многочисленных вирусных одно- и двухмембранных везикул (DMV) и митохондрий (рис. 2А, 2А1, 2В, 2С и 2D). Крупные электронно-плотные структуры, соответствующие скоплению вирусного материала в зонах активной репликации вируса, а также типичные двухмембранные сферолы, содержащие куски мембран и расположенные между образующимися вирионами, также наблюдались через 48 hpi (рис. 2B и 2D). Кроме того, вблизи плазматических мембран заметны сферолы с двойной мембраной, содержащие многочисленные вирионы (рис. 2B1 и 2D2). Эти сферолы, а также несколько скоплений вирионов наблюдались в основном на поверхности реснитчатых клеток (рис. 2А2). Эти особенности характерны для поздних стадий вирусного цикла, что подтверждает способность HAE воспроизводить асинхронный характер инфекции.

Рисунок 2. Ультраструктура инфицированного SARS-CoV-2 восстановленного носового и бронхиального HAE

SARS-CoV-2 индуцирует ранние иммунные реакции в носовом и бронхиальном HAE

Недавние исследования связывают COVID-19 с высокими плазменными уровнями некоторых иммуностимулирующих и провоспалительных цитокинов (например, IL6), особенно у пациентов с тяжелым заболеванием, предполагая потенциальную связь с плохим прогнозом. Однако до сих пор такое воспалительное состояние было гораздо менее характерно для респираторной микросреды.

Чтобы исследовать влияние инфекции SARS-CoV-2 на экспрессию генов, использовали технологию гибридизации Nanostring на носовом и бронхиальном HAE для мультиплексного обнаружения мРНК и относительного количественного определения двух комплементарных панелей генов, участвующих в иммунном ответе.

Тепловая карта и иерархический анализ выявили два различных уровня кластеризации. Независимо от носовой или бронхиальной природы модели HAE, у ∼14% изученных генов через 24 hpi заметно возрастает экспрессия, которая впоследствии снижается через 48, 72 и 96 hpi (рис. 3А). Это наблюдение было подтверждено бесконтрольным анализом данных с использованием полной генной панели. Первый компонент анализа главных компонент (PCA), на который приходится 63% дисперсии, в основном определяется временем заражения, с четким различием между 24 hpi и другими временными точками (рис. 3B, красные треугольники/точки).

Иммунные транскриптомные сигнатуры, по-видимому, частично обусловлены природой HAE после 24 hpi ( рис. 3А ). Это согласуется со вторым компонентным анализом, в котором собрано 12,6% общей дисперсии, что позволило провести четкую дифференциацию между носовым и бронхиальным отделами ( рис. 3В, зеленые / фиолетовые треугольники и точки).

В соответствии с недавним докладом Blanco-Melo и его сотрудников, ответы  интерферона (IFN) и интерферон-стимулированного гена (ISG) были почти не обнаруживаемыми в первые 24 hpi. Тем не менее, сигнатура врожденной иммунной экспрессии после 24 hpi (пик при 72–96 hpi) обусловлена ​​сильной активацией IFN I и III типов (IFNB1, IFNL1 и IFNL2, -3 и -4), а также связанных с иммунитетом генов, особенно в носовом HAE.

Только подмножество этих генов (CXCL10/IP10, CXCL2/MIP2A, IL1A, IL1B, Mx1 и ZBP1) следует той же схеме в бронхиальном HAE, хотя при общем более низком уровне экспрессии начальная модуляция IFNB1, IFNL1, CCL2/MCP1 и IL-6 в этой ткани, по-видимому, исчезает через 96 hpi. Кроме того, относительная экспрессия подмножества генов, ассоциированных с ядерным фактором kB (NF-kB) и фактором некроза опухоли α (TNF-α) (например, IL-18, IL-18R1, NFKB2, NFKBIA, TNFA и TNFAIP3), в основном остается неизменной на протяжении всей инфекции в бронхиальном HAE, но сильно повышается в носовом HAE через 48 hpi и далее (рис. 3C).

Результаты подчеркивают отличительные транскрипционные иммунные сигнатуры между носовым и бронхиальным HAE как с точки зрения кинетики, так и интенсивности, что позволяет предположить потенциальные внутренние различия в раннем ответе на инфекцию SARS-CoV-2 между верхними и нижними дыхательными путями. Эти результаты согласуются с первыми клиническими отчетами, описывающими у некоторых пациентов быстрое ухудшение респираторного состояния и общего клинического состояния на 7-10-й день после появления симптомов, что, скорее всего, связано с синдромом цитокинового шторма.

Рис. 3. Носовая и бронхиальная врожденная иммунная транскрипционная сигнатура во время течения SARS-CoV-2

Комбинированное лечение Ремдесивиром и Дилтиаземом усиливает эффективность монотерапии Ремдесивиром

Сейчас отсутствуют специфические методы лечения COVID-19. Поэтому в качестве лекарственных средств перепрофилируются одобренные и экспериментальные препараты, предназначенные для лечения других заболеваний. Эти методы лечения обычно основаны на ограниченных клинических или доклинических данных.

Ремдесивир (GS-5734) – это пролекарство аналога нуклеотида аденозина с продемонстрированной широкой противовирусной активностью против нескольких РНК-вирусов в различных доклинических моделях. Недавно Ремдесивир показал многообещающие результаты на животных моделях для лечения различных коронавирусов, включая MERS-CoV, а также в одном исследовании in vitro против SARS-CoV-2. Клинические испытания по использованию Ремдесивира для лечения пациентов с COVID-19 уже начались в Китае и Соединенных Штатах.

Дилтиазем – это антагонист Са2+ каналов, обычно используемый в качестве антигипертензивного средства для контроля стенокардии и сердечной аритмии. В недавнем исследовании Дилтиазем перепрофилировали в качестве эффективного ингибитора гриппа, направленного на хозяина. Противовирусный эффект Дилтиазема основан на его до сих пор не описанной способности индуцировать противовирусный ответ IFN, особенно IFN-1β и IFNs III типа. Сейчас проводится клиническое исследование фазы IIb для оценки эффективности комбинированной терапии Дилтиаземом и Осельтамивиром у пациентов с тяжелым гриппом (FLUNEXT TRIAL PHRC #15-0442, NCT03212716).

Логическое обоснование для тестирования такой комбинации препаратов, направленных как против вируса, так и на хозяина, согласуется с оценкой потенциальных преимуществ комбинированного лечения COVID-19 Ремдесивиром и Дилтиаземом. Эту стратегию также подтверждает недавнее исследование, описывающее артериальную гипертензию как фактор риска среди стационарных пациентов с COVID-19, а также два доклада, не предвидящих потенциальных побочных эффектов Дилтиазема или отрицательного фармакологического взаимодействия между Ремдесивиром и Дилтиаземом для лечения COVID-19.

В настоящем исследовании изучался противовирусный потенциал против SARS-CoV-2 монотерапии Ремдесивиром, а также в комбинации с Дилтиаземом, как в Vero E6, так и в HAE. На рис. 4А–4С показан сильный противовирусный эффект постинфекционного лечения Ремдесивиром в клетках Vero E6 со значениями ингибирующей концентрации 50% (IC50) 0,98 ± 0,07 мкм через 48 hpi и 0,72 ± 0,03 мкм через 72 hpi и индексом селективности (SI) 281 и 347 соответственно.

Хотя выработка клетками Vero E6 IFN-λ1 доказана, эта клеточная линия не может производить IFN I типа. Этот неполный ответ IFN, скорее всего, объясняет отсутствие значительного противовирусного эффекта, наблюдаемого при монотерапии Дилтиаземом в экспериментальных условиях. Тем не менее добавление 11,5 мкм Дилтиазема значительно усилило противовирусный эффект Ремдесивира. Об этом свидетельствует снижение значений IC50 в 3 и 2 раза по сравнению с монотерапией Ремдесивиром через 48 и 72 hpi соответственно (кривые доза-ответ на рис. 4А – 4С).

Рисунок 4. Оценка противовирусной активности комбинации Ремдесивира и Дилтиазема в клетках Vero E6 и в HAE.

Ежедневная базолатеральная обработка HAE Ремдесивиром 1,25, 5 и 20 мкм приводила к снижению внутриклеточных титров вируса SARS-CoV-2 назального HAE на 3,5, 3,1 и 7,3 log10 через 48 hpi соответственно. Снижение титров вируса HAE бронхов на 7,0, 5,8 и 7,9 log10 наблюдалось в тот же момент времени (рис. 4D, верхняя панель). Назальные и бронхиальные вирусные титры также снижались через 72 hpi после обработки 1,25 мкМ (6,9 и 7,0 log10), 5 мкМ (8,0 и 8,3 log10) и 20 мкМ (2,4 и 2,0 log10) Ремдесивира соответственно ( рис. 4E, верхняя панель).

Для модели с полным функциональным IFN-ответом неудивительно, что ежедневное лечение Дилтиаземом 90 мкм приводило к умеренному снижению внутриклеточных вирусных титров в назальном (40% и 69%) и бронхиальном (80% и 24%) HAE через 48 и 72 hpi соответственно (рис. 4D и 4E, верхняя панель).

В ходе исследования наблюдалось дополнительное снижение вирусных титров в назальном HAE на 1,45 и 1,3 log10 через 48 hpi для комбинации Ремдесивир-Дилтиазем по сравнению с монотерапией Ремдесивиром 5 и 20 мкм соответственно, хотя только первое было статистически значимым (Р = 0,0066).

Кроме того, анализ TEER показал, что противовирусные эффекты, индуцированные Ремдесивиром, Дилтиаземом или комбинацией Ремдесивир-Дилтиазем, в основном выражаются в защите целостности назального эпителиального барьера через 48 и 72 hpi (рис. 4D и 4E, нижние панели).

Независимо от их влияния на снижение вирусной активности, три испытанные комбинации Ремдесивир-Дилтиазем были особенно эффективны в защите целостности бронхиального HAE через 72 hpi. Об этом свидетельствуют значения TEER, сопоставимые с таковыми у неинфицированных контрольных групп (рис. 4Е, нижняя панель).

Ограничения исследования

Отсутствие лейкоцитов в модели HAE (например, нейтрофилов, моноцитов, дендритных клеток) может частично искажать анализ врожденного иммунного ответа, индуцированного инфекцией. Хотя это исследование демонстрируют потенциал комбинации Ремдесивир-Дилтиазем в лечении SARS-CoV-2, ее проверка и внедрение в клиническую практику нуждаются в дальнейшем изучении.

Выводы

Комбинация лекарственного средства, направленного против вируса, и лекарственного средства, направленного на хозяина, может привести к усилению противовирусных и / или иммуномодулирующих эффектов, в том числе во время иммунопатологической фазы, часто наблюдаемой в течение второй недели инфекции. Эта комбинация может также уменьшить терапевтические дозы лекарственных препаратов, нацеленных на синтез нуклеиновой кислоты, и, следовательно, минимизировать предполагаемые побочные эффекты.

Источник