Коронавирус SARS-CoV-2 вызвал пандемию COVID-19. Он изменил жизнь миллиардов людей, заразил более 150 миллионов, убил более 3 миллионов человек. Понимание механизмов заражения и всех путей проникновения вируса в организм поможет минимизировать распространение коронавирусной инфекции.

В мае 2021 года международная группа ученых из США и Дании доказала возможность прямого заражения коронавирусом через глаза. Специалисты показали, что клетки глазной поверхности и задней части глаза обладают необходимым механизмом для развития инфекции и легко заражаются в экспериментальных условиях. В серии лабораторных экспериментов специалисты установили, что наиболее подвержены заражению клетки лимбуса – переходной зоны между роговицей глаза и склерой.

Ученые также продемонстрировали важную роль сериновой протеазы TMPRSS2, которая совместно с клеточным рецептором ACE2 обеспечивает проникновение вируса в клетку и его расщепление на отдельные белки. Подавление сериновой протеазы TMPRSS2 перед заражением клетки коронавирусом полностью устраняет инфекцию.

Медицинская значимость исследования

Врачебное сообщество до сих пор не пришло к единому мнению о необходимости защиты глаз от коронавирусной инфекции. Ряд ученых считает, что риск заражения через глаза преувеличен. С другой стороны, у 1 – 5% пациентов с COVID-19 коронавирус обнаруживается в слезной жидкости. Также исследование более 25 000 пациентов выявило зависимость между защитой глаз и снижением уровня инфицирования.

Ученые объясняют, что нельзя пренебрегать даже 1% случаев глазных осложнений при COVID-19 – ведь это более 1 миллиона человек по всему миру.

Дизайн исследования

В исследовании использовались пожертвованные ткани глаз трех пациентов, умерших от коронавирусной инфекции. Чтобы определить, как здоровые клетки реагируют на заражение, ученые также использовали глазные ткани 4 людей, умерших от других болезней и не зараженных SARS-CoV-2. Донорские органы были получены из банка глаз, штат Нью Йорк (США) в течение 24 часов после смерти пациентов. В экспериментах изучались ткани передних и задних сегментов глаз: склера, роговица, лимбус, сетчатка, сосудистая оболочка, радужная оболочка.

Чтобы получить более полные данные, ученые использовали в качестве модели клеточную культуру органоидов глаза, полученную из эмбриональных стволовых клеток человека. Такая модель устранила зависимость исследования от пожертвованных глаз умерших пациентов и облегчила изучение SARS-CoV-2 в глазных тканях.

Результаты исследования

Оценка инфицированности глазной ткани доноров, умерших от коронавирусной инфекции

Сначала ученые исследовали передние сегменты глаз людей, умерших от COVID-19: склеру, лимбус, роговицу. Спайковый белок SARS-CoV-2 обнаружился в глазном эпителии всех трех доноров. Однако в строме роговицы его не было.

Белок нуклеокапсида SARS-CoV-2 также присутствовал в клетках поверхности глаза. Причем больше всего его было в лимбальной области.

Сравнение типов глазных тканей по восприимчивости к SARS-CoV-2

Затем специалисты оценили, какие области глаза наиболее восприимчивы к инфекции. Для этого ученые заражали коронавирусом SARS-CoV-2 здоровые клетки шести тканей глаза: роговицу, лимбус, склеру, радужную оболочку, сетчатку, сосудистую оболочку.

Коронавирус успешно размножался в клетках роговицы, склеры, лимбуса и сетчатки. В сосудистой оболочке и радужной оболочке экспрессия SARS-CoV-2 не обнаружилась. Количественная оценка показала, что лимбальные клетки значительно более инфицированы, чем клетки роговицы или склеры.

Анализ рецептора ACE2, через который вирус проникает в клетку, и сериновой протеазы TMPRSS2, расщепляющей вирус, показал, что сильнее всего они экспрессируются в лимбальной области.

Оценка роли сериновой протеазы TMPRSS2 и рецетора ACE2 в развитии коронавирусной инфекции

Чтобы проверить зависимость инфекции от сериновых протеаз, ученые подавляли их активность в клетках лимбуса с помощью NP-тозил-L-фенилаланин хлорметилкетона. В результате предварительная обработка клеток указанным соединением полностью устранила инфекцию. Специалисты полагают, что, возможно, лимбус наиболее подвержен заражению, поскольку в нем находятся стволовые клетки роговицы и конъюнктивы.

Чтобы понять, почему лимбус наиболее подвержен инфекции, ученые исследовали гены лимбальных клеток в сравнении с клетками роговицы. Выяснилось, что в лимбусе наиболее активны гены ACE2 и сериновых протеаз TMPRSS2, TMPRSS4, TMPRSS11E, которые ассоциированы с инфекцией SARS-CoV-2. Ученые также обнаружили, что клеткам лимбуса свойственен морфогенез ороговения эпителия. Аналогичный морфогенез ороговения свойственен первичным эпителиальным клеткам легких при инфицировании SARS-CoV-2.

Дальнейший генетический анализ показал, что в инфицированных лимбальных клтеках и инфицированных клетках бронхиального эпителия активируется много одних и тех же генов. Причем гены, ответственные за нормальные лимбальные функции, подавляются.

Выращивание множественных линий органоидов глаза

Ученые продолжили исследование на органоидной модели глаза, полученной из плюрипотентных стволовых клеток человека. Такая модель устранила зависимость исследования от пожертвованных глаз умерших пациентов и облегчила изучение SARS-CoV-2 в глазных тканях.

Через 7 недель дифференцировки стволовых клеток исследователи получили клетки развивающегося глазного поля, эктодермы глазной поверхности, эпителий сетчатки, дорсальной глазной чашки и периокулярной мезенхимы. Генетический анализ показал, что культуры развивались в сторону клеток роговицы, клеток эпидермиса, конънктивы и лимбуса. Однако эти популяции были незрелыми.

Анализ модели на наличие факторов входа коронавируса

Затем в полученных органоидах ученые оценили присутствие факторов инфицирования коронавирусом SARS-CoV-2. Оказалось, что рецептор ACE2 экспрессируется в 74% клеток глазной поверхности, особенно в популяции клеток конъюнктивы и лимбуса. Причем в иммунных ответах модельных клеток были активированы те же гены, что и в зрелых клетках многослойного эпителия, экспрессирующих ACE2.

Потом ученые исследовали экспрессию сериновой протеазы TMPRSS2 в органоидах глаза. Экспрессия TMPRSS2 обнаружилась в 82% клеток эктодермы на поверхности глаза. Причем органоид конъюнктивы и лимбуса содержал наибольшее количество таких клеток. В результате ученые предположили, что органоидная модель подходит для изучения инфекции глаза, и клетки могут быть восприимчивы к SARS-CoV-2.

Оценка инфекционности конъюнктивальных и лимбальных клеток

Чтобы количественно оценить динамику репликации вируса, специалисты заразили коронавирусом органоиды конъюнктивы и лимбуса и инкубировали их в течение 24 часов. Количество инфекционных вирионов SARS-CoV-2 выросло в 100 раз. Вирусная нагрузка достигла плато через 24 часа и сохранялась в течение трех дней.

Поскольку рецептор ACE2 и сериновая протеаза TMPRSS2 чаще встречались в органоидах конъюнктивы и лимбуса, ученые предположили, что именно эти клетки будут инфицироваться в первую очередь. Анализ вирусной РНК показал, что спайковый белок SARS-CoV-2 чаще всего экспрессируется  в органоидах роговицы и лимбуса. Причем лимбус был наиболее инфицирован. Это подтверждает предыдущее наблюдение, что клетки лимбуса посмертных доноров подвержены повышенному инфицированию, чем клетки других глазных тканей.

Оценка противовирусного ответа инфицированных клеток модели глаза

Затем ученые оценили противовирусный ответ инфицированных органоидов роговицы и лимбуса. Интерфероны I и III типов (ИФН-I, ИФН-III) служат первой линией защиты от вирусных инфекций, но успешные вирусы способны противодействовать интерфероновому ответу. Геном SARS-CoV-2 кодирует несколько белков, подавляющих клеточный противовирусный ответ, в том числе и ответ интерферона.

Ученые сравнили экспрессию интерферон-стимулированных генов (ISG) здоровых и инфицированных клеток. В инфицированных органоидах лимбуса активность ISG была ниже, чем в инфицированных органоидах роговицы, но выше, чем фоновая экспрессия в здоровых клетках. Эти данные подтверждают способность SARS-CoV-2 противодействовать работе интерферон-стимулированных генов в клетках.

Таким образом ученые показали, что коронавирус SARS-CoV-2 захватывает систему синтеза белка в инфицированной клетке для репликации собственного генома за счет нормальных функций клеток.

Выводы

Глазная инфекция SARS-CoV-2 возникает преимущественно в лимбусе, который служит резервуаром новых вирусных вирионов.

Клетки поверхности глаза очень восприимчивы к заражению SARS-CoV-2, и поэтому требуется защита глаз, как потенциального места проникновения инфекции.

Сериновая протеаза TMPRSS2 критически важна для заражения клетки коронавирусом. Подавление TMPRSS2 полностью устраняет инфекцию.

Первоисточник

S ARS-CoV-2 infects human adult donor eyes and hESC-derived ocular epithelium