Международный коллектив ученых из Китая, Саудовской Аравии и США в июле 2020 опубликовал результаты изучения:

  • кинетики размножения вируса у пациентов с COVID-19;
  • распределения вирусной нагрузки по тканям;
  • нейтрализующего ответа антител;
  • перекрестной реактивности с другими коронавирусами.

В исследовании участвовали две группы пациентов с положительным ПЦР тестом на COVID-19.

Первая группа — 12 человек, пациенты с тяжелой формой COVID-19. Эти люди нуждались в искусственной вентиляции легких и находились в отделениях интенсивной терапии. У всех была зафиксирована тяжелая пневмония.

Вторая группа — 11 человек, пациенты с легкой формой COVID-19. Этим людям не требовалась интенсивная терапия. Их клиническая картина включала лихорадку, кашель, недомогание, головную боль, легкую пневмонию.

Большая часть пациентов была старше 50 лет, средний возраст 56 лет (24 — 82 года). Мужчин — 83%.

Ученые каждые 3 — 4 дня проводили забор и лабораторный анализ биологического материала. Для изучения временного профиля поражения разных тканей ученые изучили: 84 мазка из носа, 59 мазков из зева, 36 образцов мокроты, 90 образцов кала, 79 образцов мочи, 113 образцов плазмы крови, 1 образец желудочного сока. В общей сложности изучен 461 образец.

Динамика вирусной нагрузки в разных тканях и длительность выделения РНК коронавируса

У большинства пациентов с тяжелым заболеванием выделение вируса происходило в течение 30 — 40 дней от начала исследования. У большинства пациентов с легкой формой COVID-19 вирус переставал определяться через 15 дней.

В обеих группах значительно отличалась пиковая вирусная нагрузка. В респираторных образцах (мазки из носа и горла, мокрота) вирусная нагрузка была выше в группе тяжелых пациентов. Также в этой группе дольше выделялась вирусная РНК с фекалиями. Периодически моча и плазма также были COVID-положительными:

Обозначения на рисунках:

  • Ось Х: дней от начала исследования.
  • Ось Y: обезличенные данные пациентов. РТ1 — РТ12: тяжелые пациенты из отделения интенсивной терапии. РТ3 — РТ23: пациенты с легкой формой заболевания.
  • Горизонтальный пунктир: граница между разными группами пациентов.
  • Цветные прямоугольники разной степени интенсивности: тепловая карта значений Ct вирусной нагрузки. Чем ярче — тем выше вирусная нагрузка. Соответствие тепловой шкалы цифровой — одномерный график внизу. Ct < 37 означает, что в образце обнаружена РНК коронавируса.
  • График A: анализ мазков из носа.
  • График B: анализ мазков из глотки.
  • График C: анализ мокроты.
  • График D: анализ фекалий.
  • График E: анализ мочи.
  • График F: анализ плазмы крови.

Общая динамика выработки антител IgM и IgG при COVID-19

Чтобы установить кинетику реакции антител против коронавируса SARS-CoV-2, вызывающего COVID-19, ученые анализировали ответы антител IgM и IgG к N-белкам оболочки РНК коронавируса. Для исследования использовалась плазма крови пациентов.

Антитела IgM у пациентов с тяжелым COVID-19 увеличивались в течение 1 — 2 недель с начала исследования. Через 4 недели антитела постепенно снижались.

У пациентов с легкой формой болезни антитела IgM были значительно ниже. У большинства пациентов этой группы (8/11) за все время заболевания не вырабатывалось ощутимого количества антител этого типа. Ученые подчеркивают, что диагностика IgM для пациентов с легким заболеванием не эффективна.

Антитела IgG появлялись через 10 — 15 дней. У большинства пациентов был высокий уровень этих антител, который сохранялся не менее полутора месяцев.

Для обеспечения достоверности теста ученые исследовали плазму контрольной группы здоровых доноров: 48 образцов, взятых в 2017 — 2018. У этой группы не найдено никаких специфических антител к SARS-CoV-2.

Обозначения на рисунках:

  • Ось Y: индекс количества антител. Принцип определения индекса: анализируемую сыворотку помещают в лунки лабораторного планшета, покрытые очищенным антигеном COVID-19. Если есть специфические антитела, то они связываются с антигеном. Несвязанные антитела смывают, а то, что осталось, — инкубируют при 37°C. После инкубации меняется цвет (оптическая плотность — OD) антител, связанных с антигеном. Изменение цвета определяется фотометрически при длине волны 450 нм. Трактовка результата: чем ярче окраска (выше значение индекса), тем большее количество специфических антител в образце.
  • Горизонтальный пунктир на графике: пороговое значение обнаружения антител. График ниже пунктира — антитела не обнаружены. График выше пунктира — антитела обнаружены, чем больше значение, тем больше антител.
  • Графики А: наличие антител IgM к SARS-CoV-2. Первый график — группа с тяжелой формой болезни. Второй график — группа с легкой формой болезни. Третий — контрольная группа: HD — здоровые доноры. PC — положительный контроль, NC — отрицательный контроль.
  • Графики B: наличие антител IgG к SARS-CoV-2.

Динамика выработки антител IgM и IgG в разных тканях

Чтобы исследовать присутствие антител к SARS-CoV-2 в тканях, связанных с выделением вируса, ученые анализировали разные типы биологического материала пациентов. Были исследованы образцы мокроты, бронхо-альвеолярной жидкости, плеврального выпота, мочи, фекалий. В результате выявлены ответы антител IgM и IgG к белку нуклеокапсида SARS-CoV-2.

У тяжелобольных вирусоспецифические IgM обнаружены в моче (3/10) и мокроте (4/10). Антитела IgG у этой группы пациентов присутствовали чаще: в моче (7/10) и мокроте (7/10). В одном из тяжелых случаев антитела IgM и IgG были обнаружены в бронхо-альвеолярной жидкости и плевральном выпоте. На основании полученных данных ученые делают вывод, что тяжелая коронавирусная инфекция может повреждать различные ткани, например дыхательные пути и почки.

В группе пациентов с легкой формой болезни антитела к SARS-CoV-2 в исследованных образцах не обнаружены.

В обеих группах не было антител в образцах фекалий.

Ученые предполагают, что появление IgG к SARS-CoV-2 в моче и мокроте может быть потенциальным маркером для определения тяжести заболевания.

Обозначения на рисунках:

  • Графики А: наличие антител в образцах мочи. Первый график — антитела IgM у пациентов с тяжелым COVID-19. Второй график — антитела IgM у пациентов с легкой формой болезни. Третий и четвертый графики — наличие антител IgG.
  • Графики B: наличие антител в образцах мокроты. Первый график — антитела IgM у пациентов с тяжелым COVID-19. Второй график — антитела IgM у пациентов с легкой формой болезни. Третий и четвертый графики — наличие антител IgG.
  • Графики C: наличие антител в образцах кала. Первый график — антитела IgM у пациентов с тяжелым COVID-19. Второй график — антитела IgM у пациентов с легкой формой болезни. Третий и четвертый графики — наличие антител IgG.
  • Графики D: наличие антител в образцах бронхо-альвеолярной жидкости и плевральном выпоте. Первый график — антитела IgM. Второй график — антитела IgG. HD — здоровые доноры. PC — положительный контроль, NC — отрицательный контроль.

Динамика антигенности белков SARS-CoV-2

Антигенность вирусного белка отражает силу реакции на него иммунной системы. Чем выше антигенность, тем больше вырабатывается антител против конкретного белка.

Ученые сравнили антигенность различных белков SARS-CoV-2:

  • S — белок-шип коронавируса;
  • S1 — фрагмент белка-шипа S, отвечающий за связывание с клеткой;
  • RBD — фрагмент S1, непосредственно выполняющий связывание с клеточным рецептором ACE2.
  • S2 — фрагмент белка-шипа S, отвечающий за проникновение в клетку;
  • N — белковая оболочка вирусного генома.

Ученые использовали тот же метод определения индекса количества антител, что и в эксперименте по вычислению общей динамики выработки антител IgM и IgG. Для анализа использовалась плазма крови пациентов. Исследователи покрывали антигенными белками лунки лабораторного планшета. Затем они использовали плазму пациентов, чтобы определить индекс количества антител.

В результате было установлено, что все белки: S, S1, S2, RBD, N – распознавались антителами, находящимися в плазме крови. Пик распознавания достигался через 3 — 4 недели после начала заболевания.

Распознавание белков S и S2 достигало максимума уже через 7 — 14 дней. Распознавание белков S1, RBD, N достигало максимума через 3 недели после начала заболевания.

Ученые отметили, что не было никаких очевидных различий в ответе IgG против вирусных белков между тяжелобольными и пациентами с легкой формой болезни.

Дополнительно была вычислена взаимосвязь между уровнями антител IgG против разных вирусных белков: S, S1, S2, RBD, N. Ученые установили, что большинство ответов IgG показали сильную или умеренную корреляцию. Отсутствовала корреляция между IgG против S2 и IgG против S1 и N.

Обозначения на рисунках:

  • График А: ответ антител IgG против S белка. Горизонтальный пунктир на графике: пороговое значение обнаружения антител.
  • График B ответ антител IgG против S1 белка.
  • График C: ответ антител IgG против RBD белка.
  • График D: ответ антител IgG против S2 белка.
  • График E: ответ антител IgG против N белка.
  • График F: тепловая карта взаимосвязи между уровнями антител IgG против разных вирусных белков. Чем ярче цвет — тем выше взаимосвязь.

Перекрестно-реактивные ответы антител к разным коронавирусам

На сегодняшний день известны 7 коронавирусов, которые инфицируют людей и вызывают респираторные заболевания: SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2, HCoV-OC34, HCoV-229E, HCoV-HKU1, HCoV-NL63.

Ученые оценили, насколько антитела после COVID-19 смогут защитить от других коронавирусов. Для сравнения были выбраны спайковые (S) и нуклеокапсидные (N) белки шести остальных коронавирусов. В качестве контрольной группы использовалась плазма здоровых доноров (HD).

В результате было установлено, что плазма пациентов из обеих тестовых групп распознает вирусные белки коронавирусов SARS-CoV, HCoV-OC34, HCoV-229E, HCoV-HKU1, HCoV-NL63. Только в одном случае не наблюдалось явной перекрестной реактивности между антителами, специфичными для SARS-CoV-2, вызывающим COVID-19, и MERS-CoV, вызывающим Ближневосточный респираторный синдром:

Обозначения на рисунках:

  • Красные точки — плазма пациентов с тяжелой формой COVID-19.
  • Синие точки — плазма пациентов с легкой формой COVID-19.
  • Черные точки — плазма контрольной группы здоровых доноров.
  • Зеленые точки — плазма контрольной группы для положительного контроля.

Кинетика нейтрализующей активности антител к SARS-CoV-2

Ученые оценили динамику нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 у пациентов с тяжелым и легким COVID-19. Для анализа использовалась плазма крови пациентов.

Было установлено, что 73.9% пациентов вырабатывали устойчивые нейтрализующие антитела через 3 недели после начала заболевания. Более высокие титры нейтрализующих антител были в группе тяжелобольных пациентов. Образцы плазмы, собранные у пациентов через 3 недели после начала заболевания, по-прежнему обнаруживали нейтрализующие антитела.

Плазма выздоравливающих пациентов с MERS-CoV и SARS-CoV не содержала нейтрализующих антител к SARS-CoV-2. Поэтому ученые делают вывод, что пациенты с MERS и SARS все еще могут быть уязвимы для COVID-19.

Также не было обнаружено никакой очевидной корреляции между вирусной нагрузкой и количеством нейтрализующих антител.

Обозначения на рисунках:

  • График A: зависимость количества нейтрализующих антител от длительности заболевания для группы тяжелобольных пациентов.
  • График B: зависимость количества нейтрализующих антител от длительности заболевания для группы пациентов с легким заболеванием.
  • Ось Y на графиках A и B: значение теста, оценивающего количество нейтрализующих антител по уменьшению очага поражения на 50% (FRNT50).
  • График С: сравнение перекрестно-нейтрализующих антител против псевдотипа SARS-CoV-2.
  • График D: сравнение перекрестно-нейтрализующих антител против аутентичного SARS-CoV-2.
  • Красные точки на графиках C и D: антитела, выделенные из плазмы пациентов с тяжелым COVID-19.
  • Синие точки на графиках C и D: антитела, выделенные из плазмы пациентов с легким COVID-19.
  • Зеленые точки на графиках C и D: антитела, выделенные из плазмы пациентов, инфицированных SARS-CoV.
  • Фиолетовые точки на графиках C и D: антитела, выделенные из плазмы пациентов, инфицированных MERS-CoV.
  • Черные точки на графиках C и D: данные по контрольной группе здоровых доноров.
  • График E: оценка взаимосвязи между нейтрализующим титром и уровнем S-специфических IgG.
  • График F: оценка взаимосвязи между нейтрализующим титром и уровнем N-специфических IgG.
  • График G: зависимость вирусной нагрузки Ct респираторных образцов от количества выявленных нейтрализующих антител IgG к SARS-CoV-2.

Первоисточник

Kinetics of viral load and antibody response in relation to COVID-19 severity