Цитокины руководят течением COVID-19

Ученые сравнили иммунные ответы у пациентов с легкой и тяжелой формами COVID-19 с ответами у пациентов с тяжелой формой гриппа. В отличие от гриппа, при COVID-19 воспаление вызывают повышенные уровни цитокинов TNF и IL-1β. Интерфероны I типа играют ключевую роль в воспалении при тяжелой форме COVID-19.

У большинства инфицированных COVID-19 протекает в легкой форме. Но у некоторых, особенно пожилых, пациентов, развивается тяжелая форма COVID-19, требующая применения искусственной вентиляции легких. В Китае уровень смертности от COVID-19 оценивается в 1,4%. Это ниже, чем смертность от прошлых коронавирусов SARS и MERS, но намного выше, чем от гриппа. В тяжелых случаях грипп также требует госпитализации и интенсивной терапии.

Тяжелая форма COVID-19 сопровождается острым респираторным дистресс-синдромом и системным воспалением – цитокиновым штормом. Чтобы узнать, какие факторы вызывают тяжелое течение COVID-19, ученые выполнили секвенирование одноклеточной РНК с использованием мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC). Для исследования брали кровь здоровых доноров, пациентов с легкой и тяжелой формами COVID-19 и пациентов с тяжелым гриппом. В отличие от клеток пациентов с тяжелым гриппом, во всех типах клеток пациентов с COVID-19 наблюдалось гипервоспаление. Гипервоспаление вызывали повышенные уровни цитокинов: фактора некроза опухоли (TNF) и интерлейкина-1β (IL-1β). У пациентов с тяжелой формой COVID-19, в отличие от пациентов с легкой формой, вместе с гипервоспалением наблюдался ответ интерферона I типа (IFN-I). Также воспаление, вызванное ответом IFN-I, присутствовало у пациентов с тяжелым гриппом. Ученые предположили, что ответ IFN-I играет ключевую роль в обострении воспаления при тяжелой форме COVID-19.

Интерфероны I типа обладают противовирусной активностью. Но отсроченный значительный ответ IFN-I приводит к развитию острого респираторного дистресс-синдрома и повышению смертности при коронавирусной инфекции.

Мыши, зараженные SARS-CoV, демонстрировали запаздывающий, но значительный ответ IFN-I. Ответ IFN-I вызывал накопление моноцитов-макрофагов и продукцию провоспалительных цитокинов. Мыши погибали от пневмонии с сосудистой утечкой и нарушением вирус-специфического ответа T-клеток.

Пациенты с COVID-19 страдают иммунной дисфункцией. В тяжелых случаях иммунную дисфункцию вызывают провоспалительные цитокины. У пациентов с тяжелой формой COVID-19 снижено абсолютное количество Т-клеток. Т-клетки истощаются и экспрессируют тормозные рецепторы. Но также встречается и гиперактивация T-клеток. Исследование описывает такой летальный случай COVID-19. У пациента были повышены уровни цитотоксических молекул и человеческого лейкоцитарного антигена (HLA)-DR CD38.

Иммунологические изменения при COVID-19 и гриппе

Для исследования PBMC брали у 4 здоровых доноров, 5 госпитализированных пациентов с тяжелым гриппом и 8 пациентов с COVID-19 различной степени тяжести: тяжелой, легкой, бессимптомной. У трех пациентов с COVID-19 PBMC брали дважды в разное время госпитализации.

Образцы PBMC пациентов с COVID-19 распределили по группам тяжелой (≥ 5) и легкой (<5) форм заболевания. Оценивались частота дыхания, сатурация кислорода, респираторная поддержка, температура тела, систолическое артериальное давление, частота сердечных сокращений и сознание. Пациенты с тяжелым гриппом включались в исследование до появления COVID-19: с декабря 2015 г. по апрель 2016 г. Случаи гриппа относили к тяжелым, когда требовалась госпитализация. У группы с тяжелой формой COVID-19 было значительно снижено количество лимфоцитов. А уровень С-реактивного белка в сыворотке был выше, чем у группы с легкой формой COVID-19. Для сравнения PBMC ученые выбрали 11 типов иммунных клеток: IgG B-клетки, IgG+ B-клетки, EM-подобные CD4+ Т-клетки, не-ЕМ-подобные CD4+ Т-клетки, ЕМ-подобные CD8+ Т-клетки, не-ЕМ-подобные CD8+ Т-клетки, NK-клетки, классические моноциты, промежуточные моноциты, неклассические моноциты и дендритные клетки (DC).

Значительные иммунологические изменения наблюдались только при тяжелой форме COVID-19 и тяжелом гриппе.

Тяжелая форма COVID-19 Тяжелый грипп
Доля клеток увеличилась классические моноциты классические моноциты
Доля клеток снизилась DC
неклассические моноциты
промежуточные моноциты
NK-клетки
EM-подобные CD8+ T-клетки
EM-подобные CD4+ T-клетки
DC
не-ЕМ-подобные CD4+ Т-клетки
ЕМ-подобные CD4+ Т-клетки
IgG+ В-клетки
IgG В-клетки

Генные изменения при COVID-19 и гриппе

Кластерный анализ моноцитов показал, что COVID-19 обладает характерными паттернами экспрессии генов во всех типах клеток PBMC. Независимо от типа клеток на иммунные клетки периферической крови при COVID-19 влияют распространенные медиаторы воспаления. Характер экспрессии генов при легком и тяжелом COVID-19 и тяжелом гриппе отличается. Но присутствуют общие транскриптомные сигнатуры во всех типах моноцитов и DC. Возможно, это показывает общие механизмы, которые лежат в основе врожденных иммунных ответов при тяжелом гриппе и тяжелом COVID-19.

Тяжелую и легкую формы COVID-19 объединили в группу COVID-19 и определили специфические для COVID-19 и гриппа изменения в генах для каждого типа клеток по сравнению со здоровой группой доноров.

COVID-19 Грипп
Активированы NFKB1
NFKB2
IRF1
CXCR
CXCL10
STAT1
TLR4
гены HLA класса II
гены субъединиц иммунопротеасомы

Также обычно активируются TNF, TGFB1 , IL1B и IFNG. Сравнение COVID-19 и гриппа показало, что при COVID-19 активированы NFKB1, NFKB2 и TNF, а при гриппе – STAT1, TLR4 и гены субъединиц иммунопротеасомы.

Высокая активность генов воспалительного ответа присутствует как при COVID-19, так и при гриппе. Но гены факторов транскрипции, включая воспалительные факторы (NFKB1 / 2 и STAT4), активировались только при COVID-19.

В отличие от гриппа, при COVID-19 наблюдался ограниченный ответ генов, связанных с сигнальными путями IFN-I и IFN-II, а также путями Т-клеточных рецепторов и адаптивным иммунным ответом.

Модульный паттерн экспрессии в зависимости от типа клеток
CD8+ T NK Все типы моноцитов Все типы T-клеток DC
COVID-19 NFKB1 / 2
JUN
TNF
NFKB1 / 2
JUN
TNF
IL1B
NFKBID
OSM
IL1B
NFKBID
OSM
Грипп GBP1
TAP1
STAT1
IFITM3
OAS1
IRF3
IFNG
CXCL10
TLR4
GBP1
TAP1
STAT1
IFITM3
OAS1
IRF3
IFNG
CXCL10
TLR4

Сравнивая COVID-19 и грипп, дифференциально экспрессируемые гены были доминирующими в CD8+ Т-клетках и во всех типах моноцитов.

Четкие субпопуляции CD8+ Т-клеток при COVID-19 и гриппе

Субкластерный анализ EM-подобных и не-EM-подобных CD8+ T-клеток выявил специфические для COVID-19 и гриппа транскриптомные сигнатуры. Заболевания были идентифицированы в кластере не-EM-подобных CD8+ T-клеток. Гены, экспрессируемые при COVID-19, отражают активацию иммунного ответа: CD27, RGS1, CCL5, SELL и RGS10. Сетевой анализ белкового взаимодействия показал, что при гриппе активируются PRF1, GNLY, GZMB и GZMH, а при COVID-19 – GZMK, GZMA, CXCR3 и CCL5. Повышенная экспрессия генов, активированных IFN-γ: STAT1, TAP1, PSMB9 и PSME2, наблюдалась только при гриппе. Пути ответа на IFN-I и IFN-II в большей степени были связаны с гриппом. А пути ответа на TNF или IL-1β – с COVID-19.

Транскрипционные сигнатуры классических моноцитов при COVID-19

Классические моноциты играют решающую роль в воспалительных реакциях. Субкластерный анализ классических моноцитов и GSEA показали, что специфические для легкой / тяжелой форм COVID-19 гены были обогащены TNF / IL-1β-чувствительными генами, а специфические для гриппа гены были обогащены как TNF / IL-1β-чувствительными, так и IFN-I-чувствительными генами. Это показывает, что, по сравнению с COVID-19, при гриппе доминирует ответ IFN-I.

Кластеры генов гриппа + тяжелого COVID-19 и генов, специфических для тяжелого COVID-19, помимо обогащения TNF / IL-1β-чувствительными генами, показали сильную ассоциацию с генами, реагирующими на IFN-I. Это значит, что тяжелая форма COVID-19 приобретает чувствительные к IFN-I признаки в дополнение к TNF / IL-1β – воспалительным свойствам.

Ответ IFN-I в дополнение к воспалительному ответу TNF / IL-1β при тяжелой форме COVID-19

Ученые сравнили классические моноциты между легкой и тяжелой формой COVID-19. Анализ дифференциально экспрессируемых генов показал, что при тяжелой форме COVID-19 была повышена регуляция стимулированных интерфероном генов (ISG): ISG15, IFITM1 / 2/3 и ISG20. И TNF / IL-1β-чувствительные, и IFN-I-чувствительные гены были обогащены специфичными для тяжелого COVID-19 генами.

Ученые измерили плазменные концентрации TNF, IL-1β, IL-6, IFN-β, IFN-γ и IL-18 в большей группе пациентов с COVID-19. Среди этих цитокинов уровни IL-6 и IL-18 были значительно увеличены при тяжелой форме COVID-19 по сравнению с легкой формой. В плазменных концентрациях других цитокинов различий не было. Эти результаты показывают, из-за перекрывающихся эффектов цитокинов сигнатуры чувствительных к цитокинам генов нельзя просто объяснить несколькими цитокинами.

Для дальнейшего сравнения тяжелой и легкой форм COVID-19 ученые использовали PBMC, взятые в разные периоды заболевания у одного пациента. Гены тяжелой формы COVID-19 ассоциировались с воспалительным ответом, связанным как с IFN-I, так и с TNF / IL-1β. Этого не наблюдалось среди генов легкой формы.

TNF – воспалительный цитокин. Толл-подобные рецепторы (TLR) активируют иммунный ответ и индуцируют экспрессию в моноцитах. TNF вызывает толерантность иммунной системы к TLR. IFN-I вызывает гипервоспалительный ответ и устраняет толерантность, вызванную TNF.

Анализ генного модуля подтвердил, что при тяжелой форме COVID-19 вызванный IFN-I воспалительный ответ связан с TNF-индуцированной толерантностью к TLR. Это показывает, что ответ IFN-I может усугубить гипервоспаление за счет устранения механизма отрицательной обратной связи.

Подтверждение гипервоспалительных свойств в сочетании с ответом IFN-I в тканях легких в летальном случае COVID-19

Для подтверждения связи ответа IFN-I с гипервоспалением ученые использовали данные о последовательности РНК легочных тканей пациентов с летальным COVID-19. При тяжелом COVID-19 была повышена регуляция IFITM1, ISG15 и JAK3 и понижена регуляция RPS18 в тканях легких и классических моноцитах. Анализ наборов генов, чувствительных к цитокинам, обнаружил в тканях легких как IFN-I, так и TNF / IL-1β-воспалительный ответ. Анализ дифференциально экспрессируемых генов легкого и тяжелого COVID-19 показал, что гены в посмертных тканях легких были связаны со специфическими для тяжелой формы COVID-19 генами.

Недавнее исследование SARS-CoV-2 на клетках in vitro, на хорьках и посмертных образцах легких пациентов с летальным COVID-19 показало, что ответы IFN-I и IFN-III ослаблены. Но в настоящем исследовании ученые пришли к противоположному результату: сигнальный путь IFN-I и гены врожденного иммунного ответа были относительно активированы в посмертных образцах легких пациентов с летальным COVID-19. У хорьков SARS-CoV-2 вызывает заболевание легкой формы. Настоящее исследование показывает, что реакция IFN-I активируется только при тяжелой форме COVID-19, но не при легкой. Это подтверждают посмертные образцы легких пациентов с летальным COVID-19. Недавнее исследование COVID-19 также показало устойчивый ответ IFN-I в дополнение к провоспалительному ответу в бронхоальвеолярном лаваже пациентов с COVID-19. Также повышенная регуляция IFN-I-чувствительных генов была продемонстрирована в кишечных органоидах, инфицированных SARS-CoV-2.

Выводы

На течение и исход COVID-19 влияют как воспалительные цитокины: TNF, IL-1β и IL-6, так и патологический ответ интерферона I типа. В мышиной модели инфекции SARS-CoV время ответа интерферона I типа определяет исход заболевания. Отсроченный ответ IFN-I усиливает воспаление, тогда как ранний ответ IFN-I подавляет репликацию вируса. Необходимо дальнейшее изучение противовоспалительных стратегий, направленных как на воспалительные цитокины, так и на поздний ответ интерферона I типа.

Источник