Повреждение ДНК запускает в клетках цепочку реакций, которая приводит к воспалению и активации иммунной системы. Чаще всего эти процессы изучали на опухолях, поэтому их значение для нормальных тканей долго оставалось в тени.
При лечении рака головы и шеи облучение неизбежно затрагивает здоровые слюнные железы. В результате могут повреждаться нормальные ткани, снижаться функция слюнных желез и развиваться ксеростомия — сухость во рту, которая серьезно ухудшает качество жизни пациентов.
Восстановление поврежденных тканей во многом зависит от стволовых клеток. Ранее было показано, что, если при лучевой терапии удается сохранить участки слюнных желез, где сосредоточены стволовые и прогениторные клетки, риск ксеростомии заметно снижается. При этом на способность этих клеток делиться и самообновляться влияют изменения в микроокружении, возникающие в ответ на стресс. Один из важных факторов — интерфероны I типа (ИФН-I), выработка которых может усиливаться после радиационного повреждения ДНК и запускать иммунный ответ. Поэтому важно понять, как именно облучение вызывает ответ ИФН и как он отражается на стволовых клетках нормальных тканей.
Изучать эти механизмы непосредственно в организме сложно, так как стволовые клетки слюнных желез редки и чаще всего находятся в покоящемся состоянии. По этой причине широко используют органоиды слюнных желез — трехмерные структуры, выращенные из стволовых клеток. Они хорошо воспроизводят свойства нормальной ткани и позволяют подробно изучить процессы самообновления, дифференцировки и реакцию на повреждение ДНК.
Реакция нормальных тканей зависит от степени повреждения ДНК, вызванного различными методами облучения. Это хорошо видно при сравнении фотонной лучевой терапии, которая остается стандартом лечения опухолей головы и шеи, и протонной терапии. Протонная терапия позволяет точнее подобрать и доставить дозу облучения к опухоли и меньше затрагивает окружающие ткани. Кроме того, она может вызывать иные клеточные ответы, активируя специфические сигнальные пути и в ряде случаев эффективнее уничтожая раковые клетки.
Голландские ученые исследовали органоиды слюнных желез мышей, обогащенные стволовыми и прогениторными клетками, и показали, что протонное облучение вызывает более сильный ответ ИФН-I после активации транспозабельных элементов (ТЭ) и образования цитоплазматической двухцепочечной РНК (дцРНК). В итоге усиливается активность стволовых и прогениторных клеток и их способность к самообновлению — как в органоидах, так и в экспериментах на мышах.
Протонное облучение вызывает более сильные ответ интерферона и активность стволовых клеток слюнных желез, по сравнению с фотонным
Облучение органоидов слюнных желез фотонами и протонами в дозе 7 Гр вызывало сходное снижение их выживаемости, однако протонное облучение приводило к более высокой способности к самообновлению. Это проявлялось в повышенной эффективности образования органоидов, что указывает на различия в реакции стволовых и прогениторных клеток.
Оба вида облучения вызывали выраженные изменения экспрессии генов, связанных с иммунным ответом и воспалением, при этом реакция ИФН-I, в частности интерферона-β, была значительно сильнее после протонного облучения. Это сопровождалось повышенной экспрессией генов, стимулированных ИФН (ISG), и более активной активацией сигнального пути STAT1.
Сигнальный путь ИФН-I является ключевым регулятором активности стволовых клеток и регенерации тканей. Анализ РНК отдельных клеток выявил усиление ответа ИФН-I во всех клеточных популяциях облученных органоидов, особенно после протонного облучения. Наиболее сильный ответ ИФН-I наблюдался в популяции стволовых и прогениторных клеток Sox9+, включая подмножество активно делящихся клеток. В этих клетках протонное облучение вызывало более выраженную активацию процессов, связанных с митотическим клеточным циклом.
В совокупности эти результаты показывают, что протонное облучение сильнее активирует ответ ИФН-I, который может положительно влиять на активность и пролиферацию стволовых и прогениторных клеток слюнных желез, что может объяснять их повышенную способность к самообновлению, по сравнению с фотонным облучением.
Сигнальный путь cGAS-STING способствует активации ИФН-I под воздействием радиации
Анализ органоидов слюнных желез показал, что фотонное и протонное облучение вызывают сходное раннее повреждение ДНК, сопровождающееся активацией γ-H2AX и p-P53, а также сопоставимой митотической активностью. Оба типа облучения приводили к временному увеличению числа cGAS-положительных микроядерных клеток.
Оба вида облучения активировали иммунные и воспалительные процессы, а также повышали экспрессию Ifnb, ISG и активацию STAT1 на ранних этапах после облучения. Истощение cGAS или ингибирование STING существенно снижали экспрессию ISG.
Эти результаты показывают, что путь cGAS-STING является ключевым медиатором ранней активации ИФН-I в ответ на фотонное и протонное облучение.
Повреждение митохондрий способствует передаче сигналов ИФН-I, вызванной радиацией
На поздних этапах после облучения, когда количество микроядер снижалось, в органоидах слюнных желез сохранялся устойчивый ответ ИФН-I. Фотонное и протонное облучение приводили к накоплению цитоплазматической двухцепочечной ДНК, повышению уровня цитозольного сенсора нуклеиновых кислот ZBP1, увеличению массы митохондрий и снижению их мембранного потенциала, что указывает на накопление дисфункциональных митохондрий. Это сопровождалось значительным ростом количества митохондриальной ДНК в цитоплазме.
Экспериментальное истощение митохондриальной ДНК существенно снижало экспрессию ISG после обоих типов облучения. Эти данные показывают, что вызванное облучением высвобождение митохондриальной ДНК может усиливать воспалительную реакцию и ответ ИФН-I клеток слюнных желез, однако не объясняют усиленный воспалительный эффект, наблюдаемый после протонного облучения.
Протонное облучение усиливает ответ ИФН-I через активацию транспозабельных элементов и накопление цитоплазматической дцРНК
Через 6 дней после облучения в органоидах слюнных желез наблюдалось увеличение экспрессии компонентов, связывающих дцРНК, при этом их экспрессия была выше после протонного облучения, чем после фотонного. В частности, уровни сенсоров дцРНК RIG-I и MDA5 значительно возрастали после протонного облучения. Функциональная блокада RIG-I приводила к снижению экспрессии ISG, подтверждая его ключевую роль в активации ответа ИФН-I после облучения.
Микроскопический анализ выявил накопление внутриклеточной дцРНК, более выраженное при протонном облучении. Это сопровождалось поздней активацией транспозабельных элементов, включая эндогенные ретровирусы и элементы LINE-1, что также усиливалось после протонного облучения. Этот эффект был связан со снижением уровней гистона H3.3 и репрессивной гистоновой метки H3K9Me — ключевых регуляторов, подавляющих активность транспозабельных элементов.
Фармакологическое подавление метилирования гистонов в необлученных органоидах воспроизводило эти эффекты, вызывая активацию транспозонов, накопление дцРНК и усиление ответа ИФН-I.
Эти результаты показывают, что протонное облучение сильнее нарушает подавление транспозабельных элементов, что приводит к накоплению дцРНК и более выраженному ответу ИФН-I.
ИНФ-β усиливает активность стволовых и прогениторных клеток слюнных желез после облучения
Добавление ИФН-β после фотонного облучения значительно усиливало пролиферацию стволовых и прогениторных клеток и повышало эффективность образования органоидов, тогда как нейтрализация ИФН-β или ингибирование сенсора дцРНК RIG-I снижали способность стволовых и прогениторных клеток к самообновлению. Это подтверждает ключевую роль ИФН-β и RIG-I в регуляции активности этих клеток после облучения.
Результаты были подтверждены на мышах: введение ИФН-β мышам после локального облучения слюнных желез восстанавливало способность клеток к формированию органоидов. Лечение ИФН-β увеличивало число стволовых и прогениторных клеток Sox9+ и повышало их пролиферацию как в контрольных, так и в облученных тканях.
В совокупности эти данные подтверждают благотворное влияние ИФН-β на поддержание стволовых и прогениторных клеток слюнных желез и повышение их пролиферативной способности.
Вывод
Фотонное и протонное облучение органоидов слюнных желез активирует передачу сигнала ИФН-I, однако протонное облучение вызывает более выраженный и устойчивый ответ. Этот эффект связан с активацией транспозабельных элементов и накоплением цитоплазматической двухцепочечной РНК, что приводит к усиленной экспрессии ISG.
На ранних этапах после облучения ответ ИФН-I запускается через путь cGAS-STING и связан с образованием микроядер. На более поздних этапах ключевую роль начинает играть повышение экспрессии сенсора дцРНК RIG-I, особенно выраженное после протонного облучения. Протонное облучение в большей степени способствует повышенной экспрессии транспозабельных элементов (ТЭ) и усилению ответа ИФН-I.
Эти изменения приводили к более высоким активности и способности к самообновлению стволовых и прогениторных клеток Sox9+ в органоидах, облученных протонами. Введение ИФН-β усиливало самообновление стволовых и прогениторных клеток после фотонного облучения, тогда как блокада ИФН-β или ингибирование RIG-I снижали эффективность образования органоидов.
Таким образом, протонное облучение связано с активацией оси ТЭ-дцРНК-RIG-I-ИФН-I и повышенной регенеративной активностью стволовых клеток. Это может иметь значение для оптимизации лучевой терапии с учетом защиты и восстановления нормальных тканей.
Источник
IFN-I signaling enhances salivary gland stem and progenitor cell activity after irradiation
